1。1  实验材料 8

1。2  实验设备 8

1。3实验方法 9

1。3。1植物总RNA提取 9

1。3。2基因克隆 10

1。3。3 PVX重组载体构建 11

1。3。4PVX重组载体的线性化 11

1。3。5体外转录重组PVX病毒RNA 12

1。3。6接种本氏烟草及表型观察 13

2 实验结果与分析 13

2。1 TIP;1基因克隆 13

2。2 PVX/TIP；1载体构建及线性化质粒 14

2。3体外转录得到重组PVX病毒RNA 14

2。4接种后的表型观察 15

2。6相同激素条件对不同品种桂花幼胚生长形成丛生芽的影响 15

3  讨论 16

参考文献 17

致谢 18

引言

拟南芥 （Arabidopsis thaliana）是被子植物门，双子叶植物纲十字花科植物。又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。拟南芥植株较小（一个8cm见方的培养钵可种植4-10株苗）、生长周期短（从发芽到开花约4-6周）、结实多（每株植物可产生数千粒种子）。拟南芥的形态特征分明（图1），莲座叶着生在植株基部，呈倒卵形或匙形；茎生叶无柄，呈批针形或线形。侧枝着生在叶腋基部，主茎及侧枝顶部生有总状花序，四片白色匙形花瓣，四强雄蕊。长角果线形，长约1-1。5cm，每个果荚可着生50-60粒种子。拟南芥的突变体表型非常容易观察，也为突变体的筛选提供了便利条件。拟南芥的另一个优点是转基因的转化操作很方便。拟南芥是非常典型的自花受粉自交繁殖的植物，因为其基因高度纯合，这就能够保存完整的遗传性。同时，还可以方便得进行人工杂交，利于分子遗传的研究。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的，其基因组有5对染色体，大约为12500万碱基对。用理化因素处理拟南芥的突变率很高，很容易获得各种代谢功能的缺陷型。正因为以上所述的各种优点，所以拟南芥是进行植物分子生物学与遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。论文网

本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin。)是澳大利亚特有的一种烟草属植物，因具有显著的易感染性，被广泛用于植物与病原互作和植物基因功能的研究。另外，该物种测序工作已经完成，使得本氏烟草作为模式植物将具有更多可以参考的植物基因信息。本氏烟草常被用作病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)实验，另外利用农杆菌渗透本氏烟草叶片的方法能很方便地进行蛋白的瞬时表达亚细胞定位及蛋白互作实验，也使得本氏烟草成为细胞生物学和生物技术研究的重要工具之一。[22]

VIGS (Virus-induced gene silencing) 技术是依赖植物感受外源病毒侵染，启动病毒RNA 介导的转录后基因沉默机制，使植物抵御外来基因侵袭的保护措施。采用 PVX 病毒重组载体，将 GFP 序列亚克隆至 PVX 载体中，通过侵染 GFP 转基因烟草植株 16c 后，绿色荧光蛋白信号被抑制。在 UV 灯下，植物叶片又产生了叶绿体自发的红色荧光。利用PVX病毒载体介导的VIGS技术，可以研究目标基因的功能，而由于接种时的植株已长得比较大，所以针对胚胎致死的基因功能研究，尤其具有优势。