2)取1-4 ml菌液于离心管中，10000×g离心1 min，倒尽上清，收集菌体；

3)向管中加入250 μl Buffer S1（提前加入RNase），涡旋振荡至彻底悬浮菌体； 

4)加入250 μl Buffer S2，温和地颠倒翻转离心管4-6次，此步骤不宜超过5 min；

5)取上清转移至放于收集管的制备管中，10000×g离心1 min，弃滤液，再将制备管放回NA的污染），直至溶液透亮；

6)加入350 μl Buffer S3，小心地颠倒翻转6-8次（勿剧烈摇晃），13000×g离心10

7)收集管中；论文网

8)加入500 μl Buffer HB，10000×g离心1 min, 弃滤液，再将制备管放入收集管中；

9)加入700 μl DNA Wash Buffer（提前加入指定体积无水乙醇），10000×g离心1 min,弃滤液，再将制备管放入收集管中，重复此步骤一次；

10)倒掉废液，将制备管放回收集管中，13000×g离心2 min；

11)将制备管转入干净的1。5 ml离心管中，向制备管膜中央滴加60-80 μl灭菌水（65 ℃预热），室温放置1-2 min，13000×g离心1 min，所得溶液即为质粒DNA，放于4 ℃备用，长期保存放在-20 ℃冰箱。

1。2。2  DNA的酶切    酶切反应参照体系如下：

PCR扩增DNA/质粒 30 μl

酶Ⅰ 4 μl

酶Ⅱ 4 μl

缓冲液 10 μl

反应液置于37 ℃水浴15 min，85 ℃ 5 min终止反应，所加入DNA体积视具体浓度而定，最后用水补足至100 μl；若需要其它体系，按照比例扩大或缩小。

1。2。3  化学感受态细胞的制备    整个操作过程要求无菌条件，所使用离心管，移液枪头，试剂均提前放在4 ℃环境预冷，提前开启冷冻离心机并预冷。

1)用接种环蘸取少量大肠杆菌DH5α菌液于LB平板上划线，37 ℃培养至看到明显单菌落；

2)挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37 ℃过夜振荡培养；

3)按1:100的比例将菌液转接至100 ml LB新鲜液体培养基中，于37 ℃振荡培养2-3小时至OD600≈0。5；

4)将菌液转移到无菌的50 mL离心管中，冰浴10 min；

5)4 ℃，6000 r/min离心10 min，倒出上清培养液后，将离心管迅速置于冰上；

6)加入20 ml预冷的0。1 M CaCl2溶液悬浮菌体至均匀，于冰上放置30 min；

7)离心收集菌体（6000 r/min，4 ℃，10 min），倒尽上清，将离心管置于冰上；

8)用1 ml预冷的含15 %甘油的0。1 M CaCl2溶液重新轻轻悬浮菌体至均匀,将悬浮液每管100 μl分装至1。5 ml Ep管中，用液氮迅速冷冻，保存于-70 ℃冰箱备用。

1。2。4  化学转化

1)从 -70 ℃冰箱中取出装有感受态细胞的Ep管放置于冰上10 min左右，待细胞融化后，在无菌条件下向管中加入适量的连接产物或质粒DNA，用移液枪轻轻混匀内容物，将管子插入冰中放置30 min；

2)将lEp管置于42 ℃ 水浴锅中，90 s后迅速取出插入冰中，静置150 s；

3)向管中加入800 μl LB新鲜液体培养基，混匀后放置于l37 ℃ 振荡摇床培养1 h复苏细胞，转速调至180 r/min；

4)从摇床取出菌液 6000 r/min 离心3 min ，倒掉上清，用100 μl上LB液体培养基重新悬浮菌体；

5)用移液器将菌液转移至含相应抗生素的LB固体平板上，用灭菌涂布棒将菌液涂布均匀；

6)将培养基平板（培养皿）倒置放于37 ℃恒温培养箱中，12-16 h后观察菌落生长情况，挑取单菌落验证并进行后续试验。

1。2。5  DNA片段的PCR扩增和纯化    以PccS1基因组DNA和pET30a质粒为模板，利用表1-3中的引物分别扩增得到各基因的上下游片段和Km片段。