鸡血细胞体外融合的影响因素研究(2)
原液A：称取NaCl 16.0 g、KCl 8.0 g、MgSO4•7H2O 2.0 g、MgCl2•6H2O 2.0 g、CaCl2（无水）2.8 g，溶于双蒸水至1000 ml，滤纸过滤，储存于4.0 ℃；
原液B：葡萄糖20.0 g、Na2HPO4•12H2O 0.06 g、KH2PO4 1.2 g、双蒸水800.0 ml，用滤纸过滤，加入0.5 % 酚红80.0 ml，加水至1000.0 ml，储存于4.0 ℃。
Hanks液：A、B液各1 份，双蒸水18 份，用5.6% NaHCO3调节pH 至7.4。
1.2.4 不同浓度的PEG溶液（m/V）的配制[3]
(1) 分别称取PEG 6 g置于4个小烧杯中，然后放入恒温水浴锅中水浴加热，使其融化。
(2) 让PEG缓慢冷却到50～60 ℃，注意不要使PEG凝固。
(3) 向4个小烧杯中分别加入预热至50 ℃的GKN液混匀，配制成10%、30%、50%、70%的PEG溶液。
1.2.5 鸡血细胞悬液的配制[3]
(1) 家鸡的翼根静脉采血后制备抗凝全血。用注射器在鸡翼下静脉采血，注入试管后，迅速加入肝素（100 U肝素/5 ml全血），混合均匀，制成抗凝全血。
(2) 向抗凝全血的试管中加入4倍体积的0.85%的生理盐水溶液。混合均匀，制成红细胞贮备液，4 ℃ 冰箱保存。
(3) 取1 ml的鸡血细胞贮备液于刻度离心管中，加入4 ml 0.85%的生理盐水，混合均匀，放入低速离心机中，1000 r/min条件下离心5 min，弃上清。按上述条件再离心一次。
(4)将沉淀物配制成悬浮液。并采用血球板计数法将悬浮液分别稀释成细胞密度为1×106 个/ml、1×107 个/ml、1 ×108 个/ml的悬液。
1.2.6 细胞融合实验方法[4-5]
(1)不同条件下细胞融合方法
①不同鸡血细胞悬液浓度下细胞融合方法
分别取1 ml 细胞密度为1×106 个/ml、1×107 个/ml、1 ×108 个/ml的鸡血细胞悬浮液（其中含有的CaCl2 浓度为12.6 mmol/l）到3支刻度离心管，分别加入4 ml Hanks液后混匀，1000 r/min条件下离心5 min，弃上清，为使沉淀的血细胞团块松散，然后用手指多次轻弹离心管底部。向3支刻度离心管中分别加入0.5 ml浓度为50%的PEG溶液（预热至37 ℃），要沿管壁缓慢加入，边加边摇匀，加入后在37 ℃水浴锅中静置10 min。
②不同PEG浓度下细胞融合方法
按照①的操作方法进行，其中1 ml 鸡血细胞悬浮液的细胞密度固定为1×107个/ml，加入浓度分别为10%、30%、50%、70%的PEG溶液。
③不同PEG作用时间下细胞融合方法
按照②的操作方法进行，其中PEG溶液的浓度固定为50%，加入PEG溶液后静置时间分别为2 min、5 min、10 min、20 min。
④不同鸡血细胞悬液放置时间下细胞融合方法
按照③的操作方法进行，其中加入PEG溶液后静置时间10 min，1 ml鸡血细胞悬浮液分别放置5 min、10 min、15 min后再加入到离心管中。
⑤不同钙离子浓度下细胞融合方法
按照①的操作方法进行，其中1 ml细胞密度为1×107 个/ml的鸡血细胞悬浮液中含有的钙离子浓度分别为0、12.6、50.0、75.0、100 mmol/ml。
(2) 终止PEG作用及染色观察
①向各离心管中缓慢加入5 ml Hanks液，然后轻轻吹打混匀，在37 ℃水浴锅中静置5 min，终止PEG作用。
②为使细胞团分散，多次用吸管轻轻吹打细胞团，1000 r/min条件下离心5 min，使细胞完全沉降。弃上清。然后按上述条件，再次离心，弃上清，加入少许Hanks液，混匀。
③在上述各离心管中加入Janus green B 染液，用牙签搅匀，染色3 min。分别用不同的吸管吸取各刻度离心管中溶液制成装片，在显微镜下观察细胞融合情况。