SBE又称Q酶，具有双重功能，一方面它能切开以α (1-4)糖苷键连接的葡聚糖(包括直链淀粉或支链淀粉的直链区)，另一方面它又能把切下的短链通过α (1-6)糖苷键连接于受体链上。SBE在多数植物中均含有两个以上的同工型酶，依据酶的结构，底物专一性和免疫反应等特点，SBE可分为两类：同工型A和同工型B[11]。

尽管ADP-葡萄糖是细菌中糖原合成和植物中淀粉合成的共同底物，但是，糖原和淀粉中α (1-6)糖苷键合成的分支酶不同，使得糖原与淀粉结构不同。细菌糖原分支酶(GBE)以5-16个葡萄糖苷链和ADP葡萄糖为底物催化糖原分子中α (1-6)糖苷键的合成，而SBE以40个左右葡萄糖苷键和ADP-葡萄糖为底物催化其分支链形成。因此，在理论上，大肠杆菌glgB能够使葡萄糖苷键分支度更高[11]

在以往实验研究中表明，植物淀粉在生物合成过程中，SBE会催化α (1-4)葡聚糖中的α (1-6)糖苷键合成，从而在α (1-4)直链中就形成了α (1-6)分支链；大肠杆菌中，glgB基因能够编码GBE，GBE催化糖原分子中α (1-6)糖苷键合成，由于SBE和GBE调控机制不同，从而导致糖原和淀粉在结构以及功能上的不同，GBE植物体内表达对于植物体内淀粉的积累影响还不清楚。

本实验通过提取大肠杆菌的基因组并扩增其glgB基因，构建glgB基因的重组质粒pUC19-glgB；然后构建出一个植物表达载体pBIN19-glgB，为后面研究GBE在植物体内表达对植物体内淀粉积累的影响做准备。

1 材料与方法

1。1 材料

1。1。1 质粒与菌株

 大肠杆菌E。coli DH5α购自于TaKaRa公司；载体pUC19/SBD2、pBIN19/SBD2以及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105 (具有利福平抗性)是本实验室保存。

1。1。2　酶与试剂

各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker购自于南京天为公司；氨苄青霉素、卡那霉素(Kanamycine, Kan)、利福平(Rifampicin, Rif)购自于BBI公司；DNA凝胶回收试剂盒购自于Promega 公司；PCR扩增引物的合成和基因序列测序均由上海生工完成；其它试剂均为分析纯或者分子生物学级，购自于上海化学工业集团有限公司。

1。1。3  培养基来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-

LB 培养基：酵母提取物 5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7。2。

1。2 方法

1。2。1 大肠杆菌基因组DNA的提取

取1。5mL的 E。coli DH5α菌液，5000r/min离心2min，之后收集菌体。再用500μL TE缓冲液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8。0），将菌体沉淀悬浮起来。然后加入10μL溶菌酶（0。1g/mL），于37℃水浴1h。然后再加入10μL20%SDS溶液，混匀，于37℃中水浴10min。再加入100μL 5M NaCl溶液，混匀，65℃处理10min；最后12000r/min 离心15min，收集上清液。将2 μL RNAase加入上清液中，于37℃水浴30min。先用苯酚/氯仿(1:1)抽提1次，之后再用氯仿抽提1次。然后加2倍体积的无水乙醇、1/10体积的3M KAc溶液(pH8。0)于上清液中，混匀，于-20℃冰箱中保存1h。12000r/min离心15min，去其上清液，沉淀后用70%乙醇洗2次，之后室温凉干后，溶30μL TE缓冲液中。