2。5 淀粉分支程度的增加对淀粉糊化特性的影响 - 10 -

2。6 淀粉分支程度的增加对淀粉热力学性质的影响 - 11 -

2。7 转glgB基因对冻融稳定性的影响 - 12 -

结论 - 13 -

参考文献 - 14 -

致  谢 - 15 -

前言

淀粉的许多特性包括淀粉的冻融稳定性，主要是由直链淀粉/支链淀粉的比例和支链淀粉的分支程度决定的[1]。无直链淀粉的蜡质淀粉比含有直链淀粉的淀粉具有更好的冻融稳定性，而高度分支化的且含有更多短链的支链淀粉具有更高的冻融稳定性[2]。

为了改善马铃薯淀粉的冻融稳定性，可以通过基因工程的手段改变马铃薯直链淀粉和支链淀粉的结构。理论上，这种方法可以通过缩短直链淀粉长链的长度、减少支链淀粉的分支链长度、增加支链淀粉的短分支链数量来创建出具有更高冻融稳定性的淀粉。例如，运用反义抑制的方法同时下调3个淀粉合成酶基因(GBSSI，SSII和SSIII)在马铃薯中的表达，导致支链淀粉的分支链长度缩短，结果得到了一个冻融稳定性有显著改善的马铃薯淀粉[2]。在马铃薯突变体(amf)中异源表达大肠杆菌的糖原分支酶(g1gB)基因，结果发现支链淀粉的分支程度增加25%[3]。 

为了获得淀粉分支程度更高的转基因系淀粉，从而改善淀粉的冻融稳定性，将大肠杆菌糖原分支酶(g1gB)基因转化到马铃薯栽培品种Desiree中。在本研究中主要是对 g1gB基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度，淀粉的形态及理化性质的影响进行研究。

1 材料与方法

1。1材料

1。1。1植物材料

转glgB基因马铃薯植株、未转基因对照马铃薯植株(马铃薯栽培品种Desiree)。

1。1。2 酶与试剂

Taq DNA 聚合酶、DNA Marker；液氮；CTAB 抽提液；β-巯基乙醇；氯仿；异戊醇；异丙醇；乙醇；TE缓冲液；去离子水；ddH2O；DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid, 3,5-二硝基水杨酸)试剂；NaOH溶液；盐酸；苯酚溶液；浓硫酸；高氯酸溶液；I2/KI溶液；反转录试剂盒；异淀粉酶。论文网

1。2 方法

1。2。1 转化植株的PCR检测

采用优化的转化体系将植物表达载体pBIN19-glgB转化马铃薯栽培品种Desiree。经Kan抗性筛选后得到了一个转化系列，命名为glgB-xx，其中glgB代表glgB重组基因；xx代表在该系列中的株系号。glgB系列得到26个转化株系，将转基因系列中的转化株系扩繁5株后，转移到大棚中继续生长，以非转基因植株为对照。所有转基因植株在植株形态、生长特性和马铃薯块茎形态及产量等方面与对照没有明显不同。

采用CTAB法[4]提取转化植株和对照植株的叶片(叶片取自于70天的盆栽苗)基因组DNA。用液氮将100 mg 新鲜的马铃薯叶片研磨成粉末。加入500µL 65℃预热的CTAB 抽提液(2% CTAB，1。4M NaCl，20 mM EDTA，100 mM Tris-HCl)和10µL β-巯基乙醇，轻轻混匀后于65℃水浴保温30 min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)混合液，混匀，在4℃，13 000g离心5 min。取300µL上清液并加300µL预冷的异丙醇，静置20 min，13 000g离心10 min。沉淀用70%的乙醇洗涤2次，置于室温凉干后，溶解于30μLTE缓冲液。

按照大肠杆菌glgB基因序列，用Primer 5。0软件设计一对特异性引物，引物序列分别是：5'–GGGATTCTTTAGCGGCGTCATTC–3' 和5'–ATCAGCACCGAGCGTTCTTTGTC–3' ，预期扩增片段大小为1720 bp。PCR反应体系是：基因组DNA 2μL，引物各1μL，2。5 mM dNTPs 2μL，10×PCR反应缓冲液2。5μL，Taq酶1μL，加双蒸水到25μL。PCR反应程序为：95℃ 4 min，95℃ 60 s，52℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环，72℃延伸10 min。