原理:脲酶存在与大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和二氧化碳,水。土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素情况。土壤中脲酶活性的测定以尿素为基质,根据酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质,根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色靛酚,来分析脲酶活性。

试剂:(1)甲苯 (2)10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100mL。 (3)柠檬酸缓冲液(pH 6。7):184g柠檬酸和147。5g氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/L氢氧化钠将pH调至6。7,用水稀释定容至1000mL。 (4)苯酚钠溶液(1。35mol/L):62。5g苯酚溶于少量乙醇,加2mL甲醇和18。5mL丙酮,用乙醇稀释至100mL(A液),存于冰箱中;27g氢氧化钠溶于100mL水(B液)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前A液、B液各20mL混合,用蒸馏水稀释至100mL。(5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂至活性氯的浓度为0。9%,溶液稳定。 (6)氮的标准溶液:精确称取0。4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000mL,得到1mL含有0。1mg氮的标准溶液;再将此液稀释10倍(吸取10mL标准液定容至100mL)制成氮的工作液(0。01mg/mL)。

操作步骤:称取5g土样于50mL三角瓶中,加1mL甲苯,震荡均匀,15min后加10mL 10%尿素溶液和20mL pH6。7柠檬酸盐缓冲液,摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤,过滤后取1mL滤液加入50mL容量瓶中,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1小时内在分光光度计上于578nm波长处比色(靛酚的蓝色在1小时内保持稳定)。 标准曲线制作:在测定样品吸光值之前,分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液,移于50mL容量瓶中,然后补加蒸馏水至20mL,再加入4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1小时内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。

注意事项:(1)每一个样品应该做一个无基质对照,以等体积的蒸馏水代替基质,其它操作与样品实验相同,以排除土壤中原有的氨对实验结果的影响。 (2)整个实验设置一个无土对照,不加土样,其它操作与样品实验相同,以检验试剂纯度和基质自身分解。 (3)如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

结果计算:以24小时后1g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性(Ure)。来-自~优+尔=论.文,网www.youerw.com +QQ752018766-

Ure=(a样品-a无土-a无基质)×V×n/m

式中:a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N的毫克数;

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N的毫克数;

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N的毫克数;

V为显色液体积;n为分取倍数,浸出液体积/吸取滤液体积;

m表示烘干土重。

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