1。4银杏干细胞培养基配制

按照B5基础培养基的配方要求配置母液，然后吸取母液加入到含有500mL蒸馏水的1L锥形瓶中（需要过滤灭菌的试剂除外），准备25个100mL锥形瓶，封装后。一同放入高压灭菌锅里，121℃，15min。灭菌后，将锥形瓶移入超净操作台中。赤霉酸，抗坏血酸，柠檬酸需要过滤灭菌，用5mL注射器和灭菌滤头操作。过滤灭菌后按配方用量1L锥形瓶中并加入灭菌水定容至1L，混匀后分装到灭过菌的25个瓶子中，每瓶约40mL培养基，待冷却后即成所需的银杏干细胞固态培养基。

1。5银杏枝条的灭菌处理

先将流水冲洗过的银杏枝条取出用滤纸吸干，置于无菌超净工作台上，用无菌剪刀剪断，每段约2cm，放入灭好菌的锥形瓶中，用灭菌水洗3次，再用75%酒精处理30秒钟，倒去酒精后用灭菌水洗3次，接着用0。1%升汞灭菌10分钟，然后倒去升汞，再用灭菌水洗6次。

1。6银杏干细胞诱导

将处理好的银杏枝条，用灭菌的镊子取出，放在干净滤纸上，将枝条上含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织轻轻地切下，使得所获取的组织与剩余的银杏枝条的木质部分开，将获得的组织，刀切面朝上放置，接种在B5培养基中，每瓶接种3个，每次共接25瓶，弱光培养，培养温度为(23±1)℃。光照时间为12h/d，接种后培养时间为4周，以后每2周继代1次。

1。7干细胞显微观察

此步骤是观察诱导出的银杏细胞是否为干细胞，便于下一步的液体培养体系的建立。用锋利刀片切取诱导出的组织薄片至载玻片上，用中性红染液染色5-10min，后用吸水纸吸干，滴加0。6%的生理盐水，并盖上盖玻片，用吸水纸在一侧将生理盐水吸干。放在光学显微镜下观察。

1。8银杏干细胞液体培养体系建立

将诱导出的干细胞移至无菌平皿中,用接种铲轻轻压碎,转入含有40mLB5液体培养基的100mL锥形瓶中,接种量控制在2。5-3g湿重/瓶。锥形瓶置于摇床培养，培养温度23℃,暗培养,摇床转速为100r/min，每两周转接一次。

1。9银杏内酯检测方法的建立

分别称取10mg银杏内酯A、B、C和白果内酯，各溶于1mL甲醇中，用0。22μm滤头过滤，然后用高效液相-蒸发光散射器进行检测。色谱分析条件为：色谱柱为Symmetry-C18柱，250mm×4。6mm，柱温34℃，流动相为甲醇和水，蒸发光散射检测器，温度为70℃，流速：4。5L/min。根据流动相比例调整各内酯的出峰时间，使得四个峰能完全分开。

2结果与分析

2。1干细胞的诱导和继代培养

银杏新生枝条形成层、韧皮部和皮层接种于诱导培养基，培养四天未出现真菌，细菌，说明表面消毒彻底。但在培养1个星期后，在外植体上长出真菌或细菌，说明存在内生菌污染。第一批培养的外植体上全部长出内生菌。因此第二批诱导的时候在处理枝条时将枝条外表皮刮除以后再进行灭菌处理，结果第二批有25%在两个星期后也未有内生菌出现，在培养四星期左右，部分开始出现愈伤样组织（图1A）。诱导出愈伤样组织后每两周继代一次，在八星期左右出现分层现象，表层即为干细胞，而下面的组织为韧皮部等形成的愈伤（图1B）。

图1银杏干细胞诱导（A是诱导四周长出的愈伤样组织，B是诱导八周后

干细胞与愈伤细胞分层现象）

Fig。1InducedstemcellofGinkgobiloba(Aiscallusanalogusafterfourweeks,

Bisalayeredphenomenonaftereightweeks)

2。2干细胞的显微观察

将银杏干细胞和愈伤组织用锋利的刀片切成薄片，用中性红染色后在显微镜下观察，植物液泡可被中性红染色，植物干细胞存在多个小的液泡，布满整个植物细胞（图2A、2B），而银杏愈伤细胞中只有一个大的液泡存在(图2C)。红豆杉的干细胞研究表明红豆杉干细胞耐受剪切力与其中的小的液泡有关。随着培养转速升高，干细胞的生长速度和生长量较正常悬浮细胞要高。银杏细胞显微形态表明诱导出了银杏干细胞。