图2细胞中性红染色图（A和B为银杏干细胞的染色形态。C为银杏的愈伤细胞染色形态）

Fig。2Cellsstainedbyneutralred(AandBarestemcells。Ciscalluscell)

2。3银杏活性物质检测方法的建立

为了后续银杏干细胞活性物质的检测，我们建立了银杏活性物质检测的方法。首先将银杏内酯A、B、C和白果内酯用甲醇配制成标准溶液，然后根据文献的方法进高效液相-蒸发光散射器检测，结果银杏内酯C和白果内酯在相同时间出峰。为了将这两种物质分开，我们摸索了流动相甲醇和水的比例，结果在甲醇和水比例为35。5:64。5时，可将这两种物质完全分离。在此基础上，将这四种标准品配制在一起用上面的方法进行检测，结果获得完全不同出峰时间的谱图（图3）。该方法的建立可为后续银杏干细胞培养体系中活性物质的检测所用。

图3银杏内酯A，B，C和白果内酯的高效液相色谱图

Fig。3GinkgolidesA,B,CandbilobalidesanalysedbyHPLC

1：白果内酯；2：银杏内酯C；3：银杏内酯A；4：银杏内酯B

3讨论

本研究以银杏的当年生枝条为外植体，表面灭菌后，用锋利刀片将形成层、韧皮部、皮层的组织与木质部分开，形成层面朝上放置，在干细胞诱导培养基上培养，培养八周后，形成层组织膨大生长，与脱分化的愈伤组织分层，将形成层干细胞层转移到生长培养基上培养。本方法目前已经被银杏成功应用到干细胞培养体系的建立中[11]

在培养时，常会遇到污染问题，一开始则是由于操作不当。当规范操作后，少部分银杏外植体依然会污染，即发现是内生菌的污染现象，由此，当重新对外植体培养之前，对银杏枝条进行预处理，即用干净手术刀轻轻刮除外表皮后再进行灭菌处理。这种操作则大大降低了污染率，使得实验能够有效率地进行。

在对银杏枝条灭菌处理时，要严格把握灭菌时间，即水洗后，75%酒精处理30秒，再次水洗，0。1%升汞处理10分钟后水洗。如果灭菌处理时间不够，则导致诱导的干细胞被污染。如果灭菌处理时间过长，则会杀死银杏细胞，结果是诱导不出干细胞。

当在固体培养基培养至一定时间后，转入液体悬浮培养时，由于培养基灭菌不彻底，培养的一批全都污染了，因此再操作时需要注意的部分较多。比如培养基灭菌要彻底，但是培养基灭菌时间太长也不行。干细胞在固体培养时是以细胞团存在的，而液体培养时干细胞基本都以单细胞形式存在，因此需要用镊子将干细胞团捏碎，还需要过细胞筛，过筛也需要严谨的无菌操作，目前已经培养了大量的固体培养干细胞，下面可以再次进行液体悬浮培养。

因为银杏内酯对紫外光是低吸收的，而且银杏中存在有黄酮类物质的干扰，且这种干扰性比较大，因此不适合使用紫外检测器进行检测。所以可以选择灵敏度高，选择性好的蒸发激光散射检测器，对银杏内酯类活性物质进行检测。当银杏内酯A、B、C和白果内酯用甲醇配制成标准溶液，然后根据文献的方法进高效液相-蒸发光散射器检测时，因为银杏内酯C和白果内酯在相同时间出峰，所以不得不摸索出条件，使得银杏内酯C与白果内酯可以分开出峰。摸索了流动相甲醇和水的比例，结果在甲醇和水比例为35。5:64。5时，可将这两种物质完全分离，使得四种活性物质可以在一张谱图上分开出峰。该方法的建立，使得测定更为准确，方法通用性好，适合常规检测，对于后续银杏干细胞活性物质的测定提供便利的检测方法。

植物干细胞培养技术是植物细胞培养的新方向。干细胞相对于愈伤细胞遗传稳定，耐剪切，可应对传统细胞培养时所遇到的一系列问题。目前，植物干细胞培养技术还存在许多不足之处。不同的植物，干细胞的建立方法也不同，另外可能需要的培养基组分也不一样。但干细胞的巨大优势将推进植物干细胞的研究，从而推动与之相关的食品、医药和化妆品等行业的发展。