超纯水 5mL

丙酮 45mL

3。3。10 10%过硫酸铵

试剂 用量

APS 0。1g

超纯水 1mL

放入-20℃保存。

3。3。11 考马斯亮蓝快速染色脱色液

A液：

试剂 用量

异丙醇 250mL

乙酸 100mL

G250 0。5g

超纯水 补足至1L

B液：

试剂 用量

异丙醇 100mL

乙酸 100mL

G250 0。05g

超纯水 补足至1L

C液：

试剂 用量

乙酸 100mL

G250 0。02g

超纯水 补足至1L

D液：

试剂 用量

乙酸 900mL

超纯水 补足至1L

3。4 实验方法与步骤

3。4。1 样品采集及前处理

取两名健康成年男性晨起中段尿，为了去除尿液中的细胞碎片及不溶性杂质，在4℃下5000rcf离心5min，取上清后重复离心步骤，再次取上清，分别取25mL混匀，放入-80℃冷冻保存。

3。4。2 建立两种方法提取尿液总蛋白

（1） 丙酮沉淀法                                                             

1。取2mL尿液样品，加入4倍体积-20℃预冷丙酮，置于震荡混合器上震荡30s，-20℃沉淀过夜；

2。于4℃，20000rcf离心30min，弃上清，取沉淀；

3。沉淀加入5倍体积90%丙酮清洗，-20℃孵育10min；

4。于4℃，15000rcf离心15min，弃上清，重复洗涤步骤3次后风干；

5。加入100μL 8M尿素+1‰SDS裂解液，冰上裂解30min，期间每5分钟在vortex上涡旋震荡1min；

6。4℃，15000rcf离心30min取上清；来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

7。以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度，计算所得蛋白总量，重复此方法3次，3次所得蛋白总量以均数±标准差（）表示。   

（2） 超滤法

1。取2mL尿液样品，于4℃，20000rcf离心30min，去除样品中颗粒物质；

2。取上清使用3K超滤管（Amicon Ultra-0。5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane，购自millipore公司），4℃，12000rcf进行超滤；

3。使用8M尿素+1‰SDS裂解液，4℃，12000rcf置换，置换三次，每次在超滤至100μL时加入置换液（三次置换液均在置换时加入蛋白酶抑制剂，置换液按100：1加入Cocktail（100×），使Cocktail终浓度为1×。）；

4。最后超滤至100μL，从超滤管中转移蛋白溶液至EP管中；

以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度，计算所得蛋白总量，重复此方法3次，3次所得蛋白总量以均数±标准差（）表示。