耐热植酸酶菌株发酵产酶培养基条件的优化(2)
1.材料与方法
1.1菌种与材料
1.1.1菌种
本实验室已经分离得到的耐热植酸酶菌株zk1266。
1.1.2主要药品及生产厂家
葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司
牛肉膏 国药集团化学试剂有限公司
KCl 天津市风船化学试剂科技有限公司
CaCl2•2H2O 天津市凯通化学试剂有限公司
NaCl 西陇化工股份有限公司
MgSO4•7H2O 天津市风船化学试剂科技有限公司
FeSO4•7H2O 天津市风船化学试剂科技有限公司
MnSO4•4H2O 天津市风船化学试剂科技有限公司
1.1.3 主要仪器设备及生产厂家
SCW-CJ-2FD 型洁净工作台 苏州宏瑞净化科技有限公司
电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司
海尔冰箱 青岛海尔股份有限公司
立式压力蒸汽灭菌器 LS-35HJ-型，江阴滨江医疗设备有限公司
1.1.4培养基
①液体种子培养基：
蔗糖5%、牛肉膏2%、氯化钠0.05%，蒸馏水定容至100mL，pH值自然。
②初始产酶发酵培养基：
蔗糖5%、牛肉膏2%、氯化钠0.05%、氯化钾0.05%、MgSO4•7H2O 0.05%、CaCL2•2H2O 0.05%、MnSO4•4H2O 0.01%、FeSO4•7H2O 0.01%、蒸馏水定容至100mL，pH值自然。
1.2 实验方法
1.2.1 单因素影响酶活性测定
（1）不同碳源对酶活性的影响：分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麸皮为碳源，测定菌株zk1266产植酸酶的酶活性。再对选定某一种碳源以1%、2%、3%、4%、5%、6%不同浓度测定酶活性，以选择酶活性最高的碳源含量。
（2）不同氮源对酶活性的影响：分别以硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、牛肉膏、尿素、酵母粉为氮源，测定菌株zk1266产植酸酶的酶活性。再对选定某一种氮源以1%、2%、3%、4%、5%、6%不同浓度测定酶活性，以选择酶活性最高的氮源含量。
（3）不同无机盐对酶活性的影响：分别以氯化钾、氯化钠、氯化钙、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锌为无机盐，测定菌株zk1266产植酸酶的酶活性。再对选定的某一种无机盐以0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%不同浓度测定酶活性，以选择酶活性最高的指定无机盐含量。
1.2.2酶活力测定方法
取发酵液2mL于灭菌后的50mL 离心管中，然后6000rpm，4℃离心10min，取上清液，待定。
样品组：取1mL 粗酶液与9mL 1.25mmol/L植酸钠混匀，于45℃水浴30min。
再加1mL 10%的TCA，2mL 5%钼酸铵，1mL 20%亚硫酸钠，1mL 0.5%对苯二酚，摇匀，用蒸馏水定容至25mL。静置30min，测OD660值。
对照组：取1mL 粗酶液与1mL 10%的TCA，于45℃ 水浴30min。再加9mL 1.25mmol/L 植酸钠，2mL 5%钼酸铵，1mL 20%亚硫酸钠，1mL 0.5%对苯二酚，摇匀，用蒸馏水定容至25mL。静置30min，测OD660值。
1.2.3 正交设计法
把酶活力的高低作为优化培养基的依据，设置适当的培养基组合，根据单因素优化结果选择葡萄糖、蛋白胨、氯化钾3个因素，每个因素选高、中、低3个浓度进行正交试验设计。应用L9(34)正交表对各组分进行优化试验，考察不同培养基组分对酶活力的影响。各因素水平如表1所示。
按照正交试验设计，配制不同培养基，每种培养基分别取100mL准备2份（1份接种培养，另1份不接种做空白），分别装入250mL锥形瓶中培养。将冰箱保存的菌种活化后接种到新鲜的培养基中培养24h，再按1%接种量转接到不同的筛选培养基中，45℃恒温、250rpm，摇床培养96h终止培养，进行酶活力测定。