生淀粉糖化酶则是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的一类酶[4]，其可将传统的淀粉糊化、液化、糖化合并为一步直接糖化[5]，如果将其应用于无蒸煮的酒精发酵，可节约总能耗的30% ~40%[6]，因此具有良好的应用及节能前景。因此本文研究了从自然界中筛选得到一株具有较强玉米生淀粉酶水解活性的菌株Y4，并以其为实验材料进行发酵条件优化以及酶学性质的初步研究。

2 材料与方法

2。1 材料

2。1。1 土壤样本论文网

选自食堂附近以及淀粉厂附近淀粉含量高的土壤。

2。1。2 培养基

初筛富集培养基：玉米淀粉20g， NH4NO3 3g, K2HPO4 1g, MgSO4•7H2O 0。5g, NaCl 1g，KCl 0。5g, FeSO4•7H2O 0。01g, CaCl2 0。1g，定容1L。121℃灭菌30min。其中玉米淀粉110℃干热灭菌12h后加入。

初筛平板培养基：玉米淀粉20g，蛋白胨2g，NH4NO3 3g, K2HPO4 1g, MgSO4`7H2O 0。5g, NaCl 1g，KCl 0。5g, FeSO4`7H2O 0。01g, CaCl2 0。1g, 曲利苯蓝50mg，琼脂15g，定容1L。121℃灭菌30min。其中玉米淀粉110℃干热灭菌12h后加入。

液体发酵培养基：蛋白胨2g、NaCl 1g、(NH4)SO4 2g、 K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0。5g，FeSO4·7H2O 0。01g、CaCl2 0。1g自然pH，121℃灭菌20min，玉米淀粉10g，其中生玉米淀粉在110℃下干热灭菌12h，然后在常温下无菌操作加入。

2。2 方法

2。2。1 菌种筛选方法

菌种初筛：透明圈法[7-9]，将土壤中获得的菌株接种于以玉米淀粉为唯一碳源的初筛平板培养基中，可以利用生玉米淀粉作为碳源的菌株即可以存活。最后选择透明圈直径比较大的菌落进项划线分离培养，并进行酶活测定。

菌种复筛：将初筛菌株接种于液体发酵培养基中进行摇床发酵，培养温度30℃，摇床转速为150r/min，每天定时进行酶活测定，连续发酵至各菌株酶活均开始降低时停止发酵，最后选择酶活最高的菌株作为目的菌株。

2。2。2 酶活测定

以Na2HPO4柠檬酸缓冲液（pH5。0）配制的2%玉米淀粉悬浊液为底物，反应体系为：1mL粗酶液，4mL玉米淀粉悬浊液，置于摇床40℃反应30min，150r/min，反应结束后在10000r，3min条件下离心，取上清液用生物传感分析仪(SBA-40D，山东省科学院生物研究所)检测葡萄糖含量。 

酶活力单位定义：在上述条件下，1min产生1μg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U表示。

2。2。3 发酵条件优化

2。2。3。1 碳源优化文献综述

在发酵培养基中加入5种不同的碳源[5, 10]：1%生玉米淀粉、1%糊化玉米淀粉、1%葡萄糖、1%可溶性淀粉、1%生玉米淀粉加0。5%葡萄糖，进行培养基碳源优化实验，在30℃，150r/min条件下摇床培养5天，进行酶活测定。

2。2。3。2 无机氮源优化

在30℃，150r/min条件下，以：0。3% NaNO3、0。3%NH4Cl、0。3%(NH4)2SO4、0。3%尿素、0。15% NH4 NO3作为发酵培养基的无机氮源，进行培养基无机氮源优化，摇床连续培养5天，最后进行酶活测定。

2。2。3。3 有机氮源优化

分别以：0。2% 蛋白胨、0。2%牛肉膏、0。2%酵母膏、0。2%胰蛋白胨、0。2% 酵母粉作为有机氮源，进行培养基有机氮源优化，在30℃，150r/min条件下摇床培养5天，最后测出酶活。