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2.3.2 Akkermansia muciniphila全基因组图谱分析结果 10
2.4 Red同源重组结果 11
2.4.1 打靶基因的确定 11
2.4.2 质粒提取结果 11
2.4.3 pKD4扩增片段胶图 12
2.4.4 感受态细胞的制备和电转化 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献 15
肠道微生物Akkermansia muciniphila的功能基因研究
在人体胃肠道中定殖着数量庞大、种类繁多的微生物群系，在信息传递、营养物质交换和抵御病原微生物入侵方面发挥着重要作用[1]。微生物和肠道上皮细胞并不直接接触，而是由一层厚薄不均的粘液层隔离开来。粘液层的主要成分是黏蛋白[2]，是由分布在上皮组织的杯状细胞分泌的一种糖蛋白复合物，研究发现1%以上的结肠微生物都能利用糖苷酶和硫酸酯酶等酶类降解黏蛋白中的寡糖链[3]，Akkermansia muciniphila便是2004年对粘液降解菌进行识别研究时从健康白种女性的粪便中得以分离培养的[4]，它是严格厌氧革兰氏阴性菌[5,6]，呈椭圆形，占健康人结肠肠道微生物的1%-4%[7,8]，Akkermansia muciniphila 作为疣微菌门中唯一能进行培养的典型例子[9]，以及它能专一利用黏蛋白作为碳氮源这样的特性[5,6]，受到越来越广泛的关注。
一些基因组研究数据发现，A. muciniphila可以产生61种（11%分泌蛋白）与黏蛋白降解相关的酶类，如蛋白酶、糖基水解酶、唾液酸酶和硫酸酯酶[10]，黏蛋白降解产物寡糖和短链脂肪酸等物质既可以为宿主提供能量[6]，还能够在脂质代谢、糖代谢和免疫反应等生物学过程中发挥重要作用，促进肠道健康。但还有部分假设蛋白编码基因功能未被注释，它们也很有可能与黏蛋白的降解和加工过程相关[10]。目前在基因功能研究中使用最为广泛的就是基因敲除技术，该方法简单直接，可以使靶基因完全失活。通过检测野生株和所构建的基因突变株表型上的差异，达到研究此基因功能的目的[11]。Red同源重组就是一种新型的基因打靶技术，它是基于λ噬菌体Red重组酶，将导入到宿主细胞的PCR片段与特定的靶基因序列发生同源重组，并将靶基因替换，从而实现基因缺陷型菌株的构建和基因功能的研究[12]。目前该技术多用于大肠杆菌，但乔向欣在肠炎沙门氏菌、王恒梁[13]等在痢疾杆菌以及侯松旺[14]等在棉铃虫单粒饱满型多角体病毒中都利用Red系统进行了靶基因的敲除，说明Red重组技术还可用于其他宿主菌，这也为Red技术在Akkermansia muciniphila上的应用提供了依据。从基因水平对Akkermansia muciniphila进行研究的文献大多集中在国外，但关于该菌株的基因敲除工作还未见开展。本文在进行A. muciniphila全基因组测序的基础上，分析选取目的基因AKKGM001956，尝试构建AKKGM001956基因缺失菌株，研究其在黏蛋白代谢中的作用，为A. muciniphila代谢粘蛋白通路甚至于揭示其促肠道健康机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
pKD46常常作为同源重组的辅助质粒被整合上exo、bet、gam在内的整套Red系统，在阿拉伯糖启动子的诱导下高效表达Exo、Bet和Gam重组酶用以同源重组[15]。该质粒是温度敏感型的低拷贝复制子，在较低温度30℃培养时可随着菌体生长进行正常复制，温度高于37℃时该质粒会丢失，含有氨苄青霉素抗性基因（Amp）用以抗性筛选。
pKD4是高拷贝质粒，携带有卡那霉素抗性基因（Kan），在用含有该基因的外源扩增片段重组替换菌株靶序列的实验操作中，能够作为转化子抗性筛选的标志[16]。该质粒对温度不敏感，但在其抗性基因的两侧有FLP重组酶识别位点FRT，在FRT/FLP系统的共同作用下消除抗性基因。