PCR体系制备

表2。3 PCR体系制备操作表

试剂    用量 终浓度

2*GoldStarBest Master 25µl

0。4µM

27 2µl 0。4µM

1492r 2µl 0。4µM

Template DNA <0。5µg

<0。5µg/50µl

 ddH2O Up to 50 µl

PCR反应条件

表2。4 PCR反应条件

步骤 温度 时间

预变性 95℃ 10min

变性 94 30s

退火 55 30s

延伸 72 90s

终延伸 72 5s

PCR过程中需要重复操作变性、退火、延伸30-40个循环。

根据表2。3的要求添加试剂于PCR反应EP管中，根据表2。4设定PCR仪器的程序，完成PCR过程,得到扩增产物。

2。2。2醋酸菌生长特性研究

2。2。2。1 最适生长温度测定

筛选出的醋酸菌按照5%(v/v)的接种量接种于醋酸菌液体培养基，分别置于培养温度为温度20℃、温度25℃、温度30℃、温度35℃和温度40℃条件下2d，2600r/min离心17min（4℃），用无菌水洗涤2-3次，加入等体积的无菌水，以空白无菌水为参比，测取所需要的吸光度值OD600nm。

2。2。2。2 生长曲线测定

筛选出的醋酸菌按照5%(v/v)的接种量接种于醋酸菌液体培养基，置于30℃培养箱中培养，每隔12h取10mL菌液，测定5d，2700r/min离心17min（4℃），用无菌水洗涤2-3次，加入等体积的无菌水，以空白无菌水为参比，测取所需要的吸光度值OD600nm测定5d。

2。2。2。3 醋酸菌发酵过程酸度变化

筛选出的醋酸菌按照5%(v/v)的接种量接种于醋酸发酵培养基中6%（v/v），在培养温度为30℃、20 r/min培养条件下，每隔1d取样检测产酸量，测定7d。

2。2。3黄桃酒的制备

冷冻黄桃→护色（维生素C 0。6%，柠檬酸2。2%，恒温搅拌1h）→果胶酶酶解（将黄桃浆加热至45℃，加入0。1%果胶酶，恒温搅拌3h）→杀菌（在100℃水浴锅中10分钟）→迅速冷却→接种（酵母接种量0。07%，发酵温度26℃，发酵时间7d）→ 发酵（7d）→澄清→成品陈酿[18]。文献综述

2。2。4黄桃醋发酵工艺优化

2。2。4。1 理性指标测定

（1）酒精度测定

对于体积较小的待测液，用简易酒精计测定酒精含量。将待测液用移液枪加入到简易酒精计中，等待片刻倒入水槽，多润洗几遍，最后一遍不倒掉，将酒精计正拿，等到酒精计的下方滴出几滴待测液并且管内无气泡后，将酒精计倒转180°，仔细观察液面，等到不再滴水时，查看液面最高处对应的酒精度，记录数据。做多组数据时，由于本实验中待测液中酒精含量一般较少，所以每一组数据之间都需要有充分的清洗以及润洗。

大于等于50mL的待测液，用蒸馏装置蒸馏测定其酒精含量。搭建好蒸馏装置，在烧瓶里倒入50mL混匀后的待测液，再加入50mL蒸馏水，在加热装置上将烧瓶放加热，收集装置处放一个100mL干净的量筒。直至蒸馏出的馏出液达到50mL，用酒精比重计测量待测液的酒精含量，记录数据。试验结束后，将仪器洗净，归还原位。