国内对三叶青的研究也日益重视，在人工栽培、组织培养等不同领域开展了一系列的研究，并取得了不错的研究成果。然而暂时鲜有关于从三叶青块根分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。就此，本文简单尝试了三叶青块根中内生真菌的多样性的分离和鉴定，以期为进一步研究内生真菌对三叶青生长发育的影响奠定基础。

1 材料与方法

1。1  实验材料

三叶青采自浙江省丽水市庆元县山区野生种，种植于杭州师范大学塑料大棚中。

1。2  三叶青块根石蜡切片的制作

1。2。1 材料固定

采摘三叶青块根，放在水中用毛笔轻轻刷洗干净，用刀片切成0。5 cm3左右的小块，立即放入100 mL福尔马林（FAA，由70%酒精90 mL + 冰醋酸5 mL + 37%-40%甲醛5 mL组成）固定液中以杀死原生质并凝固材料组织。

1。2。2  脱水

三叶青块根在FAA固定液中浸泡约48 h后，依次转入浓度逐渐增加的酒精中：83%酒精中2 h（每隔1 h抽气一次）；95%酒精中2 h；纯酒精中30 min，共三次。

1。2。3  透明

为了包埋剂及封固剂的进入，脱水后将材料放入含少许番红粉的酒精、二甲苯各半的溶液中90 min，直至纯二甲苯三次，每次停留30 min。若材料放入1/2纯酒精 + 1/2二甲苯中时，溶液变混，则表明材料脱水不干净，将材料逐步退回至纯酒精中再次脱水。

1。2。4  浸蜡

将石蜡熔化后，冷凝时搅拌使空气进入石蜡，然后切成小块浮于二甲苯上至溶液成为1/2石蜡、1/2透明剂时为止，避免材料与石蜡直接接触引起皱缩。40℃放置6 h，然后打开管盖放入58℃温箱中让透明剂慢慢挥发，2 h后将原液倾去，用镊子将材料放入熔融石蜡的小烧杯中，隔3 h换一次纯蜡，9 h后即可进行包埋。

1。2。5  包埋

使用硬而光滑的纸折成纸盒，将融化的石蜡连同材料一并倾入此盒内。用在酒精灯上烧热的镊子迅速将材料按所需的切面及材料之间的间隔整齐地排列，并水平放入冷水，使快速凝固。用小刀在材料四周切出适当的深沟，用手将蜡块分裂，使每一蜡块仅包含一个材料。

1。2。6  切片

取一一面锯出纵横沟纹的长方形硬木块，将带沟纹的一侧浸渍融化的废蜡中，然后把蜡块粘上，将解剖针烧热，烫去融蜡块与木块的结合部位，使其牢固。将刀片装到切片机上，把木块安置于机器上并调整位置使材料切片与切片刀口保持平行，调节切片的厚度，右手转动把手进行切片，左手将蜡带用毛笔托住从而能够连续的切片。

1。2。7  粘片

在载玻片上滴几滴蒸馏水，将切好后的蜡片背面（即光面）轻轻放在液面上，载玻片置于烘片机上，蜡片受热后慢慢伸直，用滤纸吸去多余的水分即可。

1。2。8  脱蜡染色

将切片置于纯二甲苯中处理10 min，待溶去石蜡后置于1/2二甲苯+1/2纯酒精中5 min，然后从纯酒精经各级浓度酒精下降至染色剂溶液中染色。操作依次如下：

试剂 处理时间

纯酒精 5 min

95%酒精 5 min

83%酒精 5 min

70%酒精 5 min

50%酒精 5 min

1%番红染液 2 h

50%酒精 5 min

70%酒精 5 min

83%酒精 5 min