2。2  实验方法 11

2。2。1 ZJ-GAS质粒提取 11

2。2。2酶切验证 12

2。2。3茎泽兰突变PCR 12

2。2。4  Dpn I酶处理产物、转化Tranl-Bule感受态细胞 13

2。2。5  菌落PCR 14

2。2。6  提取突变后质粒，并转化到BL21(DE3)感受态细胞 15

2。3  实验结果 15

2。3。1  ZJ-GAS质粒提取 15

2。3。2  酶切验证结果 16

2。3。3  突变PCR琼脂糖凝胶验证结果 17

2。3。4  菌落PCR琼脂糖凝胶来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766 验证结果 17

2。3。5  突变后测序结果 18

3   紫茎泽兰中倍半萜合酶基因的表达以及催化性质的研究 18

3。1  实验材料 18

3。1。1  实验试剂 18

3。1。2  实验仪器3。2。1  倍半萜合酶的诱导表达 20

3。2  实验方法及步骤 20

3。2。2  蛋白收集 20

3。2。3  蛋白凝胶电泳（SDS-PAGE凝胶电泳） 21

3。2。4  倍半萜合酶的催化性质研究 22

3。3  实验结果及分析 23

3。3。1  蛋白凝胶电泳 23

3。3。2  反应产物的验证结果 27

4    实验总结及展望 27

参考文献 28

致谢 29

1   引言

据韦会平等发表的紫茎泽兰不同生长部位中β-榄香烯的含量测定显示，紫茎泽兰自然晒干叶片中β-榄香烯的含量高达0。083%[1]，所以提出从紫茎泽兰中提取β-榄香烯，这不仅可以开辟β-榄香烯的原料来源，还可以为我国第一大外来入侵物种紫茎泽兰的治理和开发利用开辟新的思路。

1。1  紫茎泽兰及榄香烯的简介

紫茎泽兰(Epatorium adenophorum Sreng。)是菊科泽兰属多年生草本植物，因其茎、叶柄呈紫色,故名紫茎泽兰[1]。这种植物原产于墨西哥、牙买加一带，1875年引种到澳大利亚, 随后在新西兰、泰国、越南等地迅速蔓。约于20世纪40年代传入我国云南省，现已在我国西南地区广泛分布，并仍以约60 km∕年的速度向东和向北扩散。至目前为止，紫茎泽兰以蔓延了云南省约80%面积的土地。由于其超快的传播速度，一旦侵入草场,林地,荒地,很快就形成单种优势群落, 给农、林、牧业及生态环境带来了极大的危害。近几年来，人们对紫茎泽兰的治理除害力度不小，但是都远远敌不过它的传播速度。所以我们便积极开发利用，将紫茎泽兰作为饲料、肥料和能源物质，并且开发其药用价值，化害为利。近年来实验研究更是从紫茎泽兰植物中分离得到倍半萜类化合物榄香烯。论文网

榄香烯是我国首个从中药中发现其抗癌活性成分并成功开发为具有自主知识产权的广谱抗癌二类新药[2]，是具有高效、低毒、广谱的抗癌活性的天然萜类化合物，其主要生物学活性是降低肿瘤细胞的有丝分裂能力，诱发肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长[3]。临床应用的榄香烯制剂含β-榄香烯65%以上，同时还含有 γ- 榄香烯、δ- 榄香烯、榄香醇和异呋吉马烯等杂质[4]，榄香烯口服乳和注射液药物在临床上已经取得了显著的疗效。但是原料药的标准化、规范化栽培技术及重金属、农药、化肥等控制方面与国际先进水平仍然存在较大的差距，导致所产中药药效成份含量不稳定，产生榄香烯原料药从植物分离提取成本高、纯度低以及化学全合成步骤繁琐、要求条件苛刻等缺点，限制了榄香烯的广泛应用。因此，开发高效的生物合成β-榄香烯的制备技术具有现实意义和应用价值。我们希望能够通过研究和改进生物合成途径中的关键酶来减少生物合成中产生的副产物。