菜单
　　

    KH2PO4                    0.48 g
    加ddH2O至2L，调    pH至7.4，室温放置备用。
    1.1.3 仪器设备
    进口的PCR 反应仪购自德国Eppendorf 公司；
    核酸电泳仪购于北京优尔一公司；
    紫外凝胶成像系统和蛋白电泳仪购于BIO-RAD公司；
    恒温水浴锅购于上海森信有限公司；
    低温台式离心机购自Eppendorf 公司；
    美国sonics超声破碎仪。
    1.2实验方法
    1.2.1 cvs11-M的克隆
    1.2.1.1引物
    根据 Gen Bank上cvs11毒株M基因（序列号：ADJ29910.1）的核苷酸序列设计引物，筛选后，酶切位点选择BamH I (GGATCC)和Hind III(AAGCTT)，引物由上海生工公司合成，引物名称序列见下表。
    Primer name    Primer sequence
    Primer-F    28a-BamH-M-F: CGCGGATCCATGAACGTTCTACGCAAGATAG
    Primer-R    28a-Hind3-M-R: CCCAAGCTTTTATTCTAGAAGCAGAGAAGAG
    1.2.1.2 cvs11株M蛋白基因的扩增回收
    cDNA制备：
    使用Trizol法提取RNA：1）取适量狂犬病病毒液，加入1mL Trizol，轻轻混匀充分；2）加入200μL 三氯甲烷，剧烈震荡15s 后，室温静置2-3min；3）4℃ 12000r/min 离心15min；4）取450μL 上清，加入等体积异丙醇沉淀RNA，稍微混匀，室温放置5min，4℃，12000 r/min 离心10+1min；5）弃去上清后，1mL 70%乙醇处理沉淀（RNA）（上下轻柔颠倒），4℃，7500r/min 离心5min；6）弃去上清；同步骤5）；7）弃掉上清，待酒精挥发后，加入15-20μL DEPC水，室温静置10min，取2μL测浓度后立即进行反转录；
    反转录：取上述提取的总RNA 1μg，分别向其中加入12μL ddH2O，随机引物1μL，将该混合液混合均匀后，置于65℃水浴锅中孵育5min 后，冰上复性2min。
    5×Reaction Buffer                                     4μL
    dNTPs (10mM）    2μL
    Ribolock RNase Inhibitor      1μL
    RevertHid M-Mul VRT       1μL
    上述配的体系    12μL
    Total Volume    20μL
    PCR仪器中扩增循坏参数：25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min。cDNA制备完成。接下来进行PCR扩增
  1. 上一篇：猪肺炎支原体醛缩酶的致病机制研究
  2. 下一篇：八种消毒剂对大肠杆菌和葡萄球菌杀灭效果的研究

  1. 毛细管电泳分析中药成分...

  2. Osboren大豆蛋白理化特性及...

  3. 帕金森病致病蛋白LRRK2的...

  4. 微管蛋白抑制剂CA4及其衍生物的四氮唑修饰究

  5. 新型抗H1N1禽流感病毒药物...

  6. 微管蛋白抑制剂CA4及其衍生物的脒盐修饰研究

  7. 中药有效成分与血浆蛋白结合的分析研究

  8. 浅析中国古代宗法制度

  9. g-C3N4光催化剂的制备和光催化性能研究

  10. 现代简约美式风格在室内家装中的运用

  11. 江苏省某高中学生体质现状的调查研究

  12. 上市公司股权结构对经营绩效的影响研究

  13. NFC协议物理层的软件实现+文献综述

  14. 高警觉工作人群的元情绪...

  15. C++最短路径算法研究和程序设计

  16. 中国传统元素在游戏角色...

  17. 巴金《激流三部曲》高觉新的悲剧命运

　　

About

优尔论文网手机版...

主页：http://www.youerw.com

关闭返回