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3 试验方法与材料
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
产腈水解酶基因工程菌E.coli BL21 (DE3)，实验室保藏。
3.1.2 培养方法
LB培养基：蛋白胨16 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L
LB培养：自平板取一环菌体，无菌接入装液5 mL LB培养基的试管中，37 ℃，180 rpm培养6 h。
种子培养基：蛋白胨16 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，氨苄青霉素。
种子液培养：250 mL摇瓶，装液量为50 mL，接入LB培养液50 μL，30 ℃，180 rpm培养12 h。
发酵培养基：蛋白胨16 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖3 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，NaCl 5 g/L，氨苄青霉素AMP ，诱导剂IPTG。
发酵液培养：250 mL摇瓶，装液量为50 mL，按OD值接入计算量的种子液，在30 ℃，180 rpm条件下培养14 h，在培养4 h后加入浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG。
3.1.3 主要试剂
表3.1 主要试剂明细
试剂 级别 生产厂家
葡萄糖 AR 国药集团化学试剂有限公司
胰蛋白胨 BR 国药集团化学试剂有限公司
磷酸氢二钾 AR 国药集团化学试剂有限公司
氯化钠 AR 国药集团化学试剂有限公司
NaH2PO4•2H20 AR 国药集团化学试剂有限公司
Na2HPO4•12H20 AR 国药集团化学试剂有限公司
续表3.1
试剂 级别 生产厂家
海藻酸钠 CP 国药集团化学试剂有限公司
无水氯化钙 CP 上海美兴化学试剂有限公司
酵母粉 AR OXOID
琼脂粉 BR 国药集团化学试剂有限公司
3.1.4 主要仪器
表3.2 主要仪器明细
名称 型号 生产厂家
摇床 COS-200B 上海比朗仪器有限公司
台式离心机 H1650-W 湘仪仪器有限公司
高速离心机 MULTIFUGEx3 Thermo Scientific
立式灭菌消毒锅 LD2H-100KBS 上海申安医疗器械厂
枪（移液器） 2~5000uL Eppendorf
PH计 PHS-3C 上海佑科仪器有限公司
紫外分光光度计 UV1902PC 上海凤凰光学仪器有限公司
电子天平 YP102N 上海精密科学仪器有限公司
液相色谱仪 LC20AT 岛津
旋涡混合器 XW-80A 上海精科实业有限公司
3.2 试验方法
3.2.1 固定化细胞
（1）海藻酸钠包埋法
取0.1 g干重的湿细胞加入1 ml生理盐水，混合制成菌悬浮液，再加入5 ml 3%的海藻酸钠混匀，用针头制成直径约2 mm的大小均匀的固定化凝胶小珠，于0.1 M的CaCl2溶液浸泡0.5 h后，将凝胶小珠转移到0.01 M的CaCl2溶液中，放入4 ℃冰箱中硬化2 h。用生理盐水洗涤，测活。
（2）戊二醛交联法
取0.1 g干重的湿细胞悬浮于0.1 M，PH 7.0磷酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.06 g于30 ℃下固定化1.5 h，交联后取1 mL发酵液于4 ℃，8000 rpm离心5 min，收集菌体，并于0.1 M，PH 7.0磷酸盐缓冲液悬浮洗5次，测活。