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3.2 高通量测序结果和细菌含量分布-3
3.3 微生物的多样性分析5
4 讨论9
5 结论11
参考文献12
致谢15
1 绪论在人体肠道中，生活着将近1014个微生物，他们的数量超过了人体体细胞的10倍，其中 95%为厌氧菌[1]。人体微生物群落的多样性主要受到宿主的年龄、性别、种族、基因型以及某些外在因素的影响，如生活方式、饮食习惯和抗生素的使用等[2-4]。在健康的人体肠道环境中存在着多种多样的细菌，大致分为主要菌群和次要菌群，人体肠道的健康与菌群的结构息息相关。主要菌群在数量和种类上都占优势，是以双歧杆菌和乳杆菌为代表的厌氧菌，它们对维持肠道功能正常运行、肠道细菌群落平衡、抵抗致病菌入侵方面具有重要作用[5]。次要菌群多为兼性厌氧菌，也是条件致病菌，它们有较大的流动性，包括肠球菌、肠杆菌、链球菌等[6]，兼性厌氧菌虽然含量相对较少，但它们可以消耗肠道内存留的氧气，为厌氧菌的生存提供无氧的环境，二者相互制约，共同维持肠道内环境稳定。然而，婴儿的肠道细菌在组成和数量上与成人有很大的差别[7]。肠道菌群是一个随着时间增加而不断完善和丰富的过程， 因此婴幼儿的肠道菌群有着更高的可变性和不稳定性。有研究显示，最先出现在婴儿肠道内的微生物菌群是由其母亲的肠道菌群通过血液流动获得的[8]。在出生后的一段时间，最先增殖的是大肠杆菌、肠球菌等兼性厌氧菌，当这些微生物消耗尽肠道内存有的氧气后，主要菌群如双歧杆菌、梭菌、拟杆菌等严格厌氧菌才会进行增殖，约一周后，双歧杆菌会占有绝对优势，最终实现肠道群落发育成熟[9]。完成到接近成人肠道环境基本需要三年时间[10]。所以三岁以下婴儿的肠道微生物多样性主要是由母亲肠道环境、个体体质以及外界环境所影响。腹泻作为婴幼儿常见疾病，是在全世界都受广泛关注的小儿健康问题[11]。冬春交际由于气温上升，一些致病微生物变得活跃起来，而小儿抵抗力较弱，此时细菌容易侵入人体，容易造成急性腹泻，因此初春是小儿腹泻的高发季节。小儿腹泻可大致分为感染性腹泻和非感染性腹泻。 感染性腹泻主要指由致病菌引起的如致病性大肠杆菌(EPEC)、志贺氏菌、空肠弯曲菌、耶尔森菌等[12]，同时也包括由寄生虫、真菌、病毒等引起的感染[13]；非感染性腹泻则是由于饮食不当、食物过敏、肠道功能异常等导致的腹泻，此外，据报道在婴幼儿腹泻中，有46.9%~70%的概率为乳糖不耐受儿童腹泻[14,15]，
抗生素的滥用导致的抗生素相关性腹泻(AAD)的比例也日渐增加[16,17]。由此可见，小儿腹泻的原因十分复杂，受到多种因素的控制，因此，研究腹泻小儿肠道微生物多样性可以为区分腹泻的不同致病机制提供一定的依据。在对肠道微生物的研究中， 过去人们大多采用通过微生物培养的方式研究人体肠道的菌落特点[18, 19]，但该方法只能检测出 1%~10%的肠道菌。分子生物学技术的兴起，使得包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)和单链构象多态性(SSCP)等方法[20. 21]开始被用于肠道微生物的研究中，但这些方法有其局限性，特别是不能完全反映出细菌多样性和丰度。高通量测序技术可以做出优化，它的高准确率、精确定量、数字化信号等优势，在肠道菌群的研究中得到广泛的应用[22, 23]。本文采集了白细胞增加、消化不良和正常小儿粪便样本，通过Illumina 公司的 Miseq 高通量测序平台对粪便中细菌的 16S rRNA 基因序列进行测序，16SrRNA 分子被认为是研究微生物群落的最佳靶分子[24]，保守区序列用来设计通用引物进行 PCR 扩增，而根据不同细菌可变区序列的差异将其按种属分类。通过生物信息学分析不同样本中微生物群落的多样性， 源`自*优尔?文.论~文`网[www.youerw.com旨在找到由不同原因导致的腹泻与肠道菌群之间的关系。2 材料与方法2.1 实验材料采集2016 年3 月初徐州市儿童医院的7 个腹泻小儿和采自徐州市妇幼保健院的4 个正常小儿的粪便样本以及对应的粪检化验单， 样品在冷藏条件下送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA 测序以及生物信息学的分析。2.2 粪便 DNA 的提取和 PCR 扩增使用 E.Z.N.A.®粪便 DNA 试剂盒提取样品的 DNA，并使用 NanoDrop2000检 测 DNA 的 浓 度 和 纯 度 。 PCR 正 向 引 物 为338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) ， 反 向 引 物 为806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，反应体系 20μl，其中 5X FastPfuBuffer 4μl，dNTPs 2μl，引物各 0.8μl，FastPfu 聚合酶 0.4μl，DNA 模板10ng，使用PCR仪ABI GeneAmp® 9700型。 PCR过程预变性95℃ 3分钟， 95℃变性30s，55℃退火 30s，72℃延伸 45s，进行 27 个循环，最后72℃延伸 10 分钟。将产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测，并观察电泳结果，回收电泳主要的 DNA 片段后构建文库。