1.1.1.2  细胞摄取和内涵体逃逸

非病毒DNA复合物的转染有两条路径，即复合物是否与靶向配体偶联。对于非靶向阳离子复合物，有证据显示复合物首先与细胞膜表面的蛋白多糖进行静电相互作用，从而与细胞膜相结合。1996年，Baldeschwieler等人的研究表明，对于PLL-DNA复合物，使用氯化钠抑制蛋白多糖硫酸化作用，用多糖裂解酶去除细胞表面的多糖(glycosaminoglycans, GAGs)，或者增加细胞外多糖都会显著抑制基因转染[8]。不久后，Debs等人对于阳离子脂质体-DNA复合物的研究显示出类似的趋势，由于体外缺少蛋白多糖，复合物无法转染Raji细胞。另外，当小鼠事先静脉注射了肝素酶，蛋白裂解酶后，静脉阳离子脂质体介导的DNA转染将受到抑制。然而，Ruponen等人的研究表明DNA摄取能力与阳离子载体，细胞类型，以及细胞表面多糖含量有很大关系[9]。研究证明多糖会抑制转染效率，这意着进入细胞内的复合物可能被传递到不能促进转录的细胞内室。

人们认为非靶向阳离子复合物的细胞摄取是通过各种胞吞路线进行的。2004年，Behr等人的研究表明，在转染HeLa细胞系时，PEI-DNA复合物的胞吞作用受到星孢菌素和β-环糊精的抑制，其中星孢菌素是一种蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制剂，而β-环糊精会减少细胞表面胆固醇的含量[10]。另外，将反-β-肌动蛋白偶联到荧光物质FITC和/或罗丹明修饰的PEI上，结果表明复合物进入细胞后沿肌动蛋白纤维分布。基于以上结果，该小组提出了PEI-DNA复合物进入细胞的途径，即：复合物首先与跨膜硫酸肝素蛋白多糖(配体蛋白多糖)相结合，在细胞膜表面聚集。这一聚集引起PKC磷酸化，然后配体蛋白多糖与肌动蛋白骨架通过连接蛋白相结合。该结合使得复合物由吞噬作用进入细胞。然而，该途径是否能促进翻译过程，目前仍不清楚。Pichon等人的研究表明，对于HepG2细胞系，阳离子PLL-DNA复合物可以通过依赖网格蛋白的胞吞作用或者通过巨胞饮被细胞摄取[11]。

无论非靶向载体-DNA复合物的胞吞途径如何，研究证实复合物的大小是影响细胞摄取的一大因素。Amidon等人的研究表明，Caco-2细胞摄取聚乳酸聚乙醇酸共聚物与DNA形成的复合物的能力与复合物尺寸有关，当平均粒径为100nm时，细胞摄取率最高[12]。Labhasetwar等人的研究表明，对于COS-7细胞系和HEK-293细胞系，当这一复合物的平均粒径分别为70nm和200nm时，前者的细胞摄取能力要高于后者[13]。Yao等人通过光催化反应制备了表面电荷相同，平均粒径分别为38，75，87，121，132和167nm的纳米凝胶，在四种不同的癌细胞系中，平均粒径为75和87nm的纳米凝胶复合物转染效率最高[14]。这些结果表明，非靶向阳离子载体-DNA复合物的基因转染最佳尺寸在70-90nm之间。

除了非靶向载体，人们还研究了带有受体配体的靶向载体。这些配体包括但不局限于：脱唾液酸糖蛋白，表皮生长因子(EGF)，叶酸，粘合蛋白，乳糖，甘露糖，转铁蛋白[15]。载体-DNA复合物一旦与细胞表面的受体结合，即通过依赖网格蛋白的胞吞作用进入细胞。

与非靶向载体相比，受体靶向载体-DNA复合物的尺寸影响更为显著。体外实验中，非靶向复合物和细胞膜的静电相互作用可能导致强制性的胞吞作用，尽管小一些的复合物更易被细胞摄取，粒径较大的复合物由于表面积更大，静电相互作用更强，也很容易进入细胞，这就解释了为什么有时候大颗粒的转染性能比小颗粒好。但对靶向载体而言，并不存在这种效应。2003年，Aoyama等人的研究表明，当不考虑电荷因素时，糖簇纳米粒子的尺寸不同，内化作用明显不同[16]。相关报道称基因转染的最佳平均粒径约为50nm。Gao等人的理论计算证实了这一观点，他们得出结论，最佳粒径为54-60nm[17]。