3.2 实验方法 11

3.2.1 固定化初始条件 11

3.2.2 交联剂浓度的优化 11

3.2.3 固定化条件的优化 11

3.2.4 固定化方法选择 12

3.2.5 温度稳定性 13

3.3 乙酰胆碱酯酶活性的测定 13

3.3.1 试剂 13

3.3.2 乙酰胆碱酯酶活力测定的方法 13

3.4 考马斯亮蓝法测蛋白 13

3.4.1 试剂 13

3.4.2 操作步骤 14

3.5 计算方法 14

4结果与讨论 15

4.1 考马斯亮蓝溶液的蛋白标曲 15

4.2 戊二醛浓度对固定化酶热稳定性的影响 15

4.3 不同添加剂对固定化酶的影响 16

4.3.1 蔗糖浓度对固定化酶热稳定性的影响 16

4.3.2 牛血清蛋白(BSA)浓度对固定化酶的影响 16

4.3.3 明胶浓度对固定化酶的影响 17

4.3.4 不同添加剂对固定化酶热稳定性的影响 17

4.4 温度稳定性 18

4.5 乙酰胆碱酯酶的分子模拟 19

5总结与展望 20

致谢 21

参考文献 22

1研究背景

1.1 酶与乙酰胆碱酯酶的介绍

酶是一种具有生物催化功能的高分子材料(如下图)，它是自然界的产物，所有关于酶的生命活动都能维持生物体的正常生命代谢。与其他种类催化剂相比，酶通过减少化学反应的活化，其反应速率可以大大提高；换言之，酶只需要一点活化能就能提供很大动能，它的反应速率就会加快。然而，酶高度的专一性必须在活细胞的环境下才能体现，保护酶蛋白活性中心是进行催化反应的前提。与一般催化剂相比，作为生物催化剂的酶有以下特征：(1)酶具有更高的催化效率；(2)酶的活性中心对于特定底物具有很高的亲和力，其底物专一性更高；(3)恰当的酶活量使它更有利于环境保护[1]。

乙酰胆碱酯酶是一种丝氨酸水解酶蛋白，参与中枢系统中乙酰胆碱动作电位的传递，它能够将乙酰胆碱水解成乙酸和胆碱，在脊椎和无脊椎动物的神经传导中起到重要作用[2]。此外，实验证明，经过抑制乙酰胆碱酯酶的催化活性，能够检测到食品中的农药残留。论文网

乙酰胆碱酯酶主要存在于脾脏，人血清以及胆碱能神经系统和神经肌肉接头中。在神经肌肉组织的突触后膜上的乙酰胆碱酯酶，与人类阿尔茨海默病(AD)的发生密切相关。其作用机理是降解体内的乙酰胆碱来终止膜的兴奋作用。目前，医学上常采用乙酰胆碱酯酶抑制剂(如他克林、加兰他敏、石杉碱甲等)来治疗AD，以此抑制神经键内部乙酰胆碱的降解[3]。

1.2 固定化酶的简介

1.2.1 固定化酶的定义

酶自身可溶于水，当通过物理或化学方法使酶与载体结合时，酶的流动性下降且不再具备催化活性。在工业生产中，生物酶难以降解、稳定性较差、连续操作和重复利用困难，难以成为理想的催化剂[4]。为了扩大酶的应用范围，科学家们最终确定了一个有效的改进方法：固定化酶技术。固定化酶是酶的一种酶制剂形式，它采用物理或化学手段使得酶与原体系分离，但仍能进行连续反应，并且保持高的催化效率及专一性强的优点。与游离酶不同，固定化酶稳定性和使用效率显著提高，反应后酶可以回收利用，节约了资源与能源，有利于自动化生产。但是固定后的酶活性有少许损耗，使用范围减小，对这个技术的提升和发展仍有较大空间。