2。 实验材料与仪器

2。1实验材料与试剂

  材料：松树皮提取物（Pine bark extract，PBE）：购买的含有95%原花青素的松树皮提取物

        表儿茶素（epicatechin，EC）：购买的表儿茶素标准品。

试剂：丙二醛（MDA）、牛血清白蛋白(BSA)、pH7。4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）、盐酸吡多胺（PM）、30%聚丙烯酰胺(Acr-Bis)、10%十二烷基硫酸钠(10%SDS)、过硫酸铵(APS)、1。5M Tris-HCl（pH 8。8）、0。5M Tris-HCl（pH 6。8）、终止液（TEMED）、电泳缓冲液（pH 8。3）、考马斯亮蓝R250、脱色液、转膜缓冲液、甲醇、脱脂奶粉、一抗（Rb pAb to Malon dialed hyde）、二抗（Anti-Rabbit IgG(Whole molecule) —Peroxidase antibody producted in goot）、PBST溶液（0。05%Tween-20+PBS）、ECL发光试剂、乙腈、无水甲酸、1 mol/L HCL、6 mol/L NaOH

2。2 实验仪器和设备

仪器名称及型号 生产厂商

电泳仪PowerPac Basic 美国伯乐

转膜机 Trans-Blot SD Cell 美国伯乐

电子天平 AR124CN 奥豪斯仪器（常州）有限公司

离心机  生工生物工程（上海）股份有限公司

pH计PHS-3C 上海精密科学仪器有限公司

恒温磁力搅拌机HJ-3 常州国华电器有限公司

恒温金属浴 TU-10 上海一恒科技有限公司

台式振荡器TS-1 海门市亲林贝尔仪器制造有限公司

漩涡混合器WH-866 太仓市华利达实验设备有限公司

恒温摇床TS-100B 上海天呈实验仪器制造有限公司

电热恒温水浴锅 DK-S26 上海精宏实验设备有限公司

超声波清洗器KQ-500型 昆山市超声仪器有限公司

循环水式多用真空泵 SHB-III 郑州长城科工贸有限公司

X射线摄影暗匣 AX-II 广东粤华医疗器械厂有限公司

Waters alliance 高相液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司(Waters)

色谱柱 YMC-Pack Pro C18 日本YMC公司文献综述

溶剂过滤器 天津津腾实验设备有限公司

3。 实验方法

3。1 样品处理

3。1。1松树皮提取物受试物的配置

精确称取20 mg松树皮提取物溶于1 mL70%乙醇，配成20000 ppm溶液备用。

3。1。2蛋白质修饰反应模型的建立 

（1）表儿茶素（epicatechin，EC）：精确称取4。64 mg表儿茶素溶于0。4 mL 70%乙醇配成40mM的溶液备用。

（2）盐酸吡多胺（PM）: 精确称取9。64 mg盐酸吡多胺溶（PM）于1mL PBS（孵化）中，配成40 mM的盐酸吡多胺溶液。

（3）牛血清白蛋白母液(BSA)：2 mg/mL，用PBS（孵化）配成相应浓度的溶液。

（4）10 mmol/L 的MDA配置：

通过四甲氧基丙烷（TMP）的酸水解制MDA[13-14]，配制步骤如下：加入1 mL1mol/L HCL 到50 mL容量瓶中，准确吸取加入0。0845 mL的TM,在40℃水浴锅中边震荡边加热约2。5 min，直到溶液均匀澄清。滴加6mol/L的NaOH，用pH计调节溶液的pH值至7。4。最后用pH为7。4的磷酸盐缓冲液定容至50 mL，储存4℃冰箱备用[15]。

   在EP管中按照表1配制样品，置于37℃水浴锅中孵化1天（24h）。放-20℃冰箱备用。