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四．材料和方法：
1.鱼的资源管理：斑马鱼（Danio rerio）根据Westerfield(2000)中所描述的是被保存在28.5℃。胚胎根据Kimmel et al(1995)通过自然交配和分期后收集得到。
2.质粒构建：来自于lmo4b全长cDNA（Lane et al.2002）的lmo4b编码区域是被扩大并且克隆在pCS2+MT载体上形成pCS2+-myc-lmo4b。对于玛琳效能的研究，被PCR扩增的区域包含100bp lmo4b 5’UTR并且整个编码区是被插入到pCS2+MT载体中形成pCS2+5’UTR-lmo4b-myc。注射用的在体外转录的mRNA通过与注射未标记lmo4b mRNA进行表型模拟能力及核抗myc免疫反应性的检验。
3.RNA注射：加帽的正义RNA由pCS2+-myc-lmo4b和pCS2+5’UTR-lmo4b-myc质粒用mMESSAGE mMACHINE kit方法合成。显微注射则是用美国哈弗公司的PLI-90显微注射仪完成。为了mRNA和mRNA-MO的双重注射，胚胎经4纳升适当浓度的每种mRN注射后被分开。对于两次的mRNA注射，GFP标记的mRNA被用于单次的过表达实验以标准量化每次注射的核酸量。
4.玛琳注射：与lmo4b mRNA对应的反义玛琳核苷酸通过基因工具，LLC设计并合成。两个未重叠的MO序列是5’-CTGTTCACCATCGCCTGCCGTTATT-3’(-14到11)和5’-ACGTATCTCGAAGGTCAAAGGGTGC-3’（-42到-18）。对于lmo4b对照的MO序列包含4个错配的碱基：5’-CTGaTCAgCATCGCCTGCgGTTtTT-3’(-14到11)。每个胚胎玛琳注射的剂量是4到5纳克。
5.蛋白质印迹：对于玛琳的效力研究，每个胚胎注射750pg的5’UTR-lmo4b-myc mRNA紧接着注射3纳克、6纳克或9纳克的封闭lmo4b Mos.动物Caps注射后及未注射的约3.5小时胚胎根据（Grinblat et al.1999）所描述的获得，并且在2倍的Laemmli缓冲液里重悬。来自于动物Caps的一半蛋白质样品加载到12%SDS-PAGE胶上进行电泳分离。存在的myc标记的Lmo4b蛋白质经老鼠α-myc单克隆抗体（1：10000）检测到，而且可经氧化物酶联的α小鼠抗体（1：50000）增强化学发光强度。
6.整胚原位杂交：整胚原位杂交的所有步骤都在（Sagerstrom et al,1996）中有所描述。此次研究中所用的所有克隆事先都有所描述：lmo4b(Lane et al,2002),pax2a(Krauss et al.1991),pax6b(Nornes et al.1998)rx2/3(Mathers et al.1997),emx1(Morita et al.1998)dlx3(Akimen ko et al., 1994) six3b (Seo et al., 1998) zic1 (Grinblatet al., 1998), shh (Schauerte et al., 1998), 和nk2.1a (Rohr and Concha, 2002)。对于双原位杂交，荧光探针的染色在INT（Boehringer）和BCIP（Sigma）指导下进行产生一个亮橘黄色沉淀和红片（Roche），产生亮蓝色的沉淀。图像由蔡司AxioskopIIPlus显微镜和蔡思AxioCam MRc 照相机获得并经Adobe Photoshop处理。由剃须刀片手动切成片段。
7.玛琳注射样本的头部测量：在数量上估计lmo4b抑制胚胎头部特异的缺陷，每个胚胎注射了4ng lmo4bMO或者注射了4mm-MO的对照组在10体节的阶段进行测量。我们测量了通过眼睛囊泡头部的高度，从卵黄到头顶。我们也测量了沿着nasotemporal轴的眼睛囊泡的直径，通过囊泡的中心。两组注射的胚胎测量数目为20。这些测量的操作在Ando (2005).中有所描述。平均值、标准差、标准差经计算得出，根据p检验和可信区间来判断有无显著差异。我们对每个胚胎分别从3个点进行卵黄直径的测量来判断固定方式产生的差异，并且发现没有显著的差异。测量结果见图4，由如下方式获得：胚胎去除卵黄后平坦侧向放置，并在20倍物镜下观察。区域a-d如文本中所描述，使用AxioVision LE 版本4.5.0.0中的长度测量功能(Zeiss Imaging Solutions, 2005)，并且根据显微镜的放大倍数进行校准将像素转换为μm玛琳注射与对照组胚胎中的a/d,b/d,和c/d比率用t检验进行比较。
五．结果：
1.Lmo4b在斑马鱼大脑、眼、耳及胸鳍发育中的功能。