3。2 提取基因组 17

3。3 PCR扩增目的片段 17

3。4 PCR产物的回收 18

3。5  提取质粒 18

3。6  质粒与pET-28的酶切 19

3。7 酶切凝胶回收 20

3。8  菌落PCR 21

3。9 酶切验证 22

3。10 测序 24

4 实验讨论 25

结  论 27

致  谢 28

参 考 文 献 29

1。 绪论

1。1 引言

膜蛋白是一类内部构造独特的蛋白质，它存在于生物膜上，是生物膜发挥功能的重要保证。研究发现，至少有40%小分子药物的靶标是膜蛋白，与许多疾病都密切相关，因此膜蛋白的表达纯化对膜蛋白结构功能的研究具有重要的意义。

1。2 外膜蛋白的结构及特性

本课题研究的OmpC膜蛋白，是一种外膜蛋白。外膜蛋白是一类普遍存在于原核生物的细胞外膜以及真核生物细胞器外膜的结构十分独特却又非常重要的蛋白质。

在内部构造上，他们都是β-桶状的构造，个体外膜蛋白的差异在于β-桶含有的双数个β-折叠片的数量，典型的有8-22个1；在功能上，他们的主要作用是为外膜提供通透性，从而保证外膜结构的稳定。折叠好的外膜蛋白的稳定性很强2，常温下其他可溶性蛋白在0。2%的强离子型表面活性剂------SDS（十二烷基硫酸钠）溶液中就会很快地改变原有的结构；而在同样温度下，外膜蛋白即使在2%的SDS中，依然保持原有的折叠结构。所以一般的，会把加样前有或者没有对样品进行95 ℃加热而去除折叠的SDS-PAGE称为denatured SDS-PAGE以及semi-native SDS-PAGE，而且把它用来探究外膜蛋白结构的折叠情况。

1。3 外膜蛋白的研究历程及进展

人们对外膜蛋白的探索也经历了一段坎坷而又长久的历程。起初研究者没有注意到外膜蛋白的重要性，尽管有文献报道说外膜脂多糖生成的阻碍和热致死相关，然而当时的研究者主要研究精力放到了膜间质蛋白的生成上，甚至含糊地把膜间质蛋白的生成跟外膜蛋白的生成混为一谈，其次认为细胞在胁迫状况下的死亡原因是膜间质蛋白结构的错误折叠3。后来随着研究的深入，Ried G等意识到脂多糖事实上促进了外膜蛋白的正确产生4，Mecsas J等也通过遗传筛选证实了外膜蛋白的过表达才是细胞出现来自细胞外的蛋白质生成压力的原因，激活了主要的膜间质胁迫信号途径σE通路5。进一步证据证明，膜间质的主要分子伴侣SurA以及Skp都会促进外膜蛋白的正常产生6，过表达膜间质分子伴侣能够弥补脂多糖合成缺陷的表型，从而避免外膜蛋白的异常产生。在此之后，Rizzitello AE与Sklar JG等还发现膜间质的分子伴侣------SurA与DegP和Skp之间存在着平行结构的协作关系7，SurA和Skp，SurA和de gP的双敲除柱系都呈现致死表型，而且直接影响外膜蛋白的正常产生8-10。2003年，Voulhoux R等发现了一种很特别的蛋白质--Omp8511-12，这种蛋白质可以捕获膜间质里从内膜转运来的其余的外膜蛋白中间体，然后把它引导到外膜中，它的敲除株会严重的阻碍外膜蛋白的正常产生，甚至直接造成细菌的衰亡13，这个重大发现真正地让生物学家们高度重视外膜蛋白这个以前近乎被忽视的蛋白质。随后，Wu T等发现了Omp85/YAeT/BamA这一因子，可与YfgL（BamB），NlpB（BamC），YfiO（BamD）以及SmpA（BamE）形成庞大的蛋白复合物从而产生作用14。近年来，Krojer T等在膜间质中又发现了一个新蛋白--De gP/HtrA15，一个与耐热有关的蛋白，它可以与外膜蛋白形成稳定的复合物--De gP12/24-OMP16。尽管这一复合物形成的机制还尚不明朗，但是此研究结果可以说明膜间质中的胁迫更多是由于外膜蛋白的异常而导致的结果。