最近有实验室用遗传学和生化的方法表明，主要的外膜蛋白都具有稳定的折叠中间态，也正是由于这些折叠中间态，革兰氏阴性菌才能够在胁迫条件下正常生存下去17。耐热相关蛋白DegP/HtrA通过在Skp和SurA下游识别并且分选这种折叠中间态18，从而使得细菌对胁迫环境具有抵抗的能力，并且使其具有致病性。分子伴侣活性主要负责捕获以及稳定不同折叠状态的外膜蛋白20-22，为部分折叠的外膜蛋白的插膜提供帮助，从而阻挡折叠结构错误的外膜蛋白吸附在外膜上；而蛋白酶活性主要负责消灭折叠结构错误的外膜蛋白。

1。4 本课题的主要研究内容

将克隆的目的基因在特定的宿主细胞中进行表达，对于研究一个基因的功能及其表达调控的机理具有十分重要的意义，其表达出的蛋白质可用作结构与功能的研究。本课题主要运用分子克隆技术进行膜孔蛋白OmpC的表达载体的构建，并将构建好的表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，为后续OmpC蛋白的表达纯化奠定基础。

2。 材料和方法

2。1 材料

2。1。1试剂

     本次实验所需试剂及其标准规格和生产公司如下表所示。

表2-1 所需试剂、规格以及生产厂家

2。1。2 试剂盒及内切酶

   质粒小提和DNA凝胶回收试剂盒购于康宁生命科学（吴江）有限公司；PCR产物回收和基因组提取试剂盒购于天恩泽公司。

酶切所需的BamH I以及Nde I两种限制性内切酶从Fermentas采购；dNTP、10×PCR buffer、rTaq、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase buffer等均购自大连宝生物有限公司。

2。1。3 缓冲液论文网

     本次实验所需缓冲液及用量如下表所示。

表2-2 缓冲液及用量

缓冲液 用量

TfbⅠ缓冲液 200 mL

TfbⅡ缓冲液 200 mL

50×TAE电泳缓冲液 1000 mL

6×Loading Buffer 500 mL

10%十二烷基硫酸钠溶液 1000 mL

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 1000 mL

2。1。4 常用仪器及设备

      本次实验所需要用到的仪器以及设备如下表所示。

表2-3 实验仪器、型号以及生产厂家

仪器名称 型号 生产厂家

移液器 TOP 北京大龙科技有限公司

微型高速离心机 mini-14K 杭州奥盛仪器有限公司

超速离心机 XPX-80 Beckman公司

大体积高速离心机 LYNX6000 Thermo公司

恒温混匀仪 PYJSY-N 上海真研仪器有限公司

迷你金属浴 MINIB-100H 杭州米欧仪器有限公司

恒温培养震荡器 ZWY-100H 上海智城分析仪器有限公司

电热鼓风恒温干燥箱 OH G-914385 上海新苗医疗器械有限公司

电热恒温培养箱