1。5 受磷蛋白的研究及其意义

对受磷蛋白的研究对人类和动物的健康都是具有重大意义。比较深入的研究 是从 1995 年开始，Russell 等人通过圆二色谱和核磁共振的方法测定了受磷蛋白 细胞质端 1 到 25 位的残基的结构[9]。其中在 20 个计算出来的结构中，1 到 16 位的残基都是呈规则的螺旋结构。剩下的残基呈无规则的状态。受磷蛋白经过磷 酸化作用会向无规则化的方向移动。2003 在十二烷基磷酸胆碱囊泡中用多维核 磁共振的实验方法测定了具有有生物活性的受磷蛋白整条单链的结构。在之后

体内和体外的实验均证明了受磷蛋白能形成了稳定的五聚体[10]，但是，目前 Ca2

＋-ATPase 的 Ca2＋输运机制以及能量传输机制都尚不明确。受磷蛋白五聚体具有 离子通道的功能，但是对于它具体的离子通透机制还有待挖掘。对五聚体具有的 离子选择性通道功能也是众说纷纭，有假说认为 PLN 形成了钙离子和氯离子的 选择性通道，用膜片钳的技术和电化学的方法确实也探测到该通道有多种离子通 过，也有假说认为 PLN 作为一个缓冲区或者为储存区，来储存与钙离子结合的 活泼性单体[6]。PLN 蛋白的突变将会降低 SERCA 的功能性，而这些蛋白功能的 异常会导致疾病，特别是心脏方面的疾病，对它们的功能机制的探讨是当前的研 究热点[11]。

1。6 受磷蛋白的表达优化

由于基因在不同的生物体中表达倾向不同，人体肌肉浆网受磷蛋白密码子在 在大肠杆菌中的表达水平参差不齐，所以在不改变所编码的蛋白质的前提下，改 变基因序列，提高表达水平。原始序列：

5’-ATGGAGAAAGTCCAATACCTCACTCGCTCAGCTATAAGAAGAGCCTCAA CCATTGAAATGCCTCAACAAGCACGTC来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-GCTACAGAATCTATTTATCAA TTTCTGTCTCATCTTAATATGTCTCTTGCTGATCTGTATCATCGTGATGCTTCT

CTGA-3’。图 1-3 和图 1-4 为处理前后在大肠杆菌中密码子频率图。新的密码子：

5’-ATGG来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-AGUGCAGTACCUGACTCGCAGCGCTAUUCGCCGCGCGAGC ACCATTGAAATGCCGCAGCAGGCACGTCAGAAGCUGCAGAACCUGTTTAT CAACTTCTGTCUGATCCUGAUUTGTCUGCUGCTGATCTGTATCATCGTGATG CUGCUGTGA-3’

图 1-3 优化前在大肠杆菌中密码子频率

图 1-2 优化后在大肠杆菌中密码子频率

注：深色表示密码子在同一氨基酸的含量低于 10%，浅色则表示含量高于 10%

1。7 基因克隆与蛋白的表达纯化

1。7。1 基因克隆技术

基因克隆技术是一系列技术的总称，是生物即生命科学实验的常用技术和基 础[12]。包括目的片段基因的获得，选择合适的载体，体外重组，导入受体细胞， 重组子的筛选。目的片段的获得，是基因克隆的第一步，常需要经过限制性内切 酶的处理，使其更方便于克隆。载体的选择一般来源于病毒和细菌，主要考虑: 在 宿主细胞中能保存下来并能大量复制，以得到更多目的基因 ，有多个限制酶切 点，而且每种酶的切点最好只有一个，有一定的标记基因，便于进行筛选。如携 带氨苄（amp），卡拉（kana），就可以作为筛选的标记基因。体外重组，是通文献综述

过酶连将质粒与目的片段人工连接，通过转化实验，将人工合成质粒导入受体细 胞。通过各种途径筛选阳性，比如，蓝白筛选法，PCR 筛选和限制酶酶切法等 方法。

1。7。2 基因克隆技术的发展历程

1972 年 11 月在檀香山基因克隆技术第一次被提出[13]，是在一次关于质粒讨 论的实验上。（质粒是在细菌中发现的一种环状 DNA，质粒携带某些耐抗生素 的基因）。基因克隆技术建立于 70 年代初期。在 1972 年美国斯坦福大学的伯格 等人用同一种 DNA 限制性内切酶同时切割一种猿猴病毒 DNA 和λ噬菌体 DNA， 然后用 DNA 连接产生新的重组质粒，基因克隆技术由此产生。在 1973 年，科 恩等人将一段外源 DNA 片段嵌入质粒 DNA 中，并将这个重组的新的质粒导入 大肠杆菌中，基因克隆体系第一次被完整的建立[14]。