1。8 本课题拟研究内容

本实验主要通过酶切酶连等基因克隆技术，构建受磷蛋白 PLN 的原核表达载 体，获得毫克级的高纯受磷蛋白。

2。   实验材料及方法

2。1 材料

2。1。1 菌种

大肠杆菌 BL21(DE3)作为表达的蛋白的宿主菌，DH5α作为克隆的宿主菌。

2。1。2 质粒

高拷贝的 pKS 载体用于克隆载体，pET28a 用于构建表达载体

2。1。3 工具酶和试剂盒

限制性核酸内切酶（快切酶）包括 EcoR I /Sal I 以及 DNA 连接酶 T4 DNA Ligase 等均购自 Thermo Scientific 公司。DNA 凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit）和质粒小量提取试剂盒（AxyPrep Plasmid Miniprep Kit）购自 Axygen 公司。来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-

2。1。4 分子量标准

DNA 分子量标准：DL5000 DNA Marker、（购于 TaKaRa 公司 ），保存 于-20℃。

2。1。5 培养基

LB 的培养基为细菌的生长提供丰富的营养，形象的来说是细菌的肉汤。

LB 液体培养基的制备：胰蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，氯化钠(NaCl) 5g。该用量均是 1L 的用量。利用磁力搅拌器使其完全溶解， 然后使用二级水定容，（LB 灭菌后，在常温下储存。使用时要在无菌台打开。）

LB 固体培养基的制备：胰蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，氯化钠(NaCl) 5g，15g 的琼脂粉。使用：灭菌后，将 LB 固体培养基放置在

55℃的水浴中，待培养基温度降到 55℃时加入抗生素（抗生素最终浓度为：Amp

100ug/mL,Kan 50ug/mL。），是为了温度过高导致抗生素失效，并充分摇晃使其 混合均匀。然后倒板，一般 20mL 就可以倒 1 个板子。倒好后，开盖晾 10-15 分 钟。用保鲜膜封好边，并倒置放于 4℃保存，并在一个月之内使用。

2。1。6 缓冲液以及其他溶液

1×TEA buffer:在制胶过程中要使用，以及跑胶的电解槽的溶液，实验室使 用的是 5 0×TEA buffer 取 20mL，用二级水稀释到 1L，常温下储存，以备使用。

10× Green buffer：在酶切的过程中加入 DNA 中，给酶提供一个舒适的工作环境。 染料：在制胶过程中加入 1/10000 的核酸染料，实验室购置的染料化学性质稳定， 低毒性。