1。2。2 ROS检测测定

（1）NBT染色法：将灵芝菌株在0。5mg / mL NBT（10mM磷酸钾缓冲液，pH 7。5）溶液中孵育2小时后显微镜观察菌丝胞内超氧化物含量。

（2）DCFH-DA荧光统计：用于ROS荧光测定，将无菌玻璃盖玻片置于培养皿的底部，当菌丝体在盖玻片上生长时，加入10 μl ROS专一染料DCFH-DA，28度孵育30 min，用荧光显微镜观察不同处理后胞内ROS的变化，并用荧光分析软件分析荧光强度变化。

1。2。3 胞内H2O2含量测定

利用南京建成生物工程研究所的过氧化氢含量测定试剂盒，定量测定不同处理条件下胞内H2O2含量的变化。

（1）收集不同处理菌丝，尽量吸干菌丝表面的水分，液氮速冻，-70 ℃冰箱中保存；

（2）适量新鲜菌丝，液氮预冷的研钵中研磨充分，取适量菌丝于2 ml的离心管中，加入800 μL 0。05 M磷酸缓冲液混匀，放置冰盒上，4 ℃，12,000 rpm 离心5 min，转移上清至新的离心管中。