拟南芥LysM受体样激酶的克隆与筛库载体的构建(2)
几丁质是由N-乙酰基-D-吡喃葡糖胺聚合而成的直链多糖，它广泛存在于真菌细胞壁、虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳及高等动物的细胞壁，而在植物细胞中则没有这类物质[5]。几丁质能有效诱导植物产生抗病性，并激发植物相关抗病基因的表达。Limpens E等认为植物拥有一套特有的几丁质识别系统，这个系统通过特异性识别几丁质来启动植物体对病原真菌的防御，植物几丁质应答基因的突变会降低植物对病原真菌的抗性[6]。病原菌携带有种类繁多的PAMPs，相应的，植物体也拥有丰富的识别受体。
受体样激酶(receptor-like kinases, RLKs)是一类位于细胞膜上接受外界信息并激活下游信号转导的蛋白激酶类受体，在植物的发育与防卫反应过程中发挥重要的作用[7]。编码RLKs的基因有很多种，在拟南芥中至少有610个基因，这些基因占拟南芥中编码蛋白质基因总量的2.5％[8]。LysM RLK是拟南芥的真菌几丁质诱导的抗病信号途径中的关键因子，LysM基因全长为2988bp，其中包括11个内含子区和一个1854bp长的氨基酸编码区；它所编码的蛋白质包括一个细胞外结合域、一个跨膜功能域和一个胞内激酶。突变该因子的编码序列则阻断了几丁质诱导的抗病信号途径。因此LysM RLK在植物抵抗病原真菌的防御过程中起着重要的作用[9]。
本实验选用拟南芥抗病基因LysM构建筛库载体以期在后续的酵母双杂交实验中发现更多相关抗病基因，通过研究这些基因，我们可以深入研究植物的抗病机理，也为寻找更多的抗病材料奠定了基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料及仪器
1.1.1 实验材料与试剂
哥伦比亚野生型拟南芥由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室徐克东博士提供，pGBKT7载体购自Clontech公司，大肠杆菌感受态TransB(DE3) Chemically Competent Cell购自北京全式金公司，pMD18-T载体购自TaKaRa公司。cDNA合成试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶、限制性内切酶SalⅠ和NdeⅠ、cDNA合成试剂盒；高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司；柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；植物RNA提取试剂盒购自北京康为世纪。
1.1.2 主要仪器
上海精宏实验设备有限公司的电热恒温水槽；德国Biometra公司的温度梯度PCR仪；Tanon 2500琼脂糖凝胶成像系统；德国Eppendorf Centrifage5424的高速离心机；上海智城ZHWY-1102C型恒温摇床。
1.1.3 PCR引物的设计与合成
根据Genbank(登录号为AB367524.1)已发表的LysM基因序列设计引物，由南京金斯瑞生物技术公司合成，引物如表1。
表1 引物序列
引物名称 引物序列（从5'端到3'端）
LysM-F
LysM-R GCGCATATGATGAAGCTAAAGATTTCT
ATAGTCGACCTACCGGCCGGACATAAG
1.2 实验方法
1.2.1 筛库载体pGBKT7-LysM的构建流程
本实验所用的载体为pGBKT7，这种载体能在酵母细胞中高效表达，其自身携带有编码GAL4 DNA结合结构域(GAL4 DNA binding domain, DNA-BD)的核酸序列以及转录所需的启动子与终止子。载体的多克隆位点含有一个SalⅠ酶切位点和一个NdeⅠ酶切位点。载体具有卡那抗性，便于阳性克隆的筛选（如图1）。目的基因和pGBKT7载体经双酶切后连接，构建重组质粒（如图2）。
图1 pGBKT7 载体
图2 pGBKT7-LysM载体的构建流程
1.2.2 拟南芥叶片RNA的提取及目的基因的扩增
取拟南芥幼嫩叶片提取总RNA，按照植物RNA提取试剂盒操作说明书进行，并用分光光度计上进行检测。cDNA的合成按照cDNA合成试剂盒操作说明书进行。
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