NADH氧化酶的固定化研究+文献综述(5)
1.3 本课题的研究意义
NADH氧化酶能够催化NADH生成NAD+，由于氧化还原酶中80%以NADH或NAD+作为其辅酶，而且该酶在细胞代谢调控中的重要地位，使得其在辅酶再生和微生物代谢调控方面都有较为广阔的的应用前景。本课题利用实验室保藏产NADH氧化酶的菌株H2，对其进行鉴定和活化，并从中分离纯化出NADH氧化酶，研究其酶学特性，尝试对该酶进行固定化研究，对实现NADH氧化酶的规模化生产和辅酶再生的研究与应用有重要意义。
1.4 本论文的主要研究思路
（1）菌株的活化与鉴定：将实验室保藏菌株H2进行活化，通过观察菌落形态、革兰氏染色、16S rDNA测序、MUG实验、乳糖发酵实验等来鉴定H2菌株的特性；
（2）H2菌的发酵条件探索：在探究出H2菌株特性的基础上，重点研究不同发酵时间对H2菌体生长和代谢产物NADH氧化酶活性的影响，探究最佳发酵时间。并对H2菌株进行大量发酵培养获得其菌体，为接下来的提酶工作提供菌体原材料；
（3）NADH氧化酶的分离纯化：通过对发酵所得菌体进行超声破碎来提取粗酶，并对粗酶进行硫沉、离子交换层析、亲和层析，不断分离纯化，计算每步的酶活力、比活力、纯化倍数和回收率。通过SDS-PAGE反应分离纯化效果并测定H2所产的NADH氧化酶的分子量大小；
（4）NADH氧化酶的酶学性质研究：利用分离纯化后的NADH氧化酶，研究其最适pH、最适温度、二价金属离子对其酶活的影响。通过鉴定产物中是否存在H2O2来探索H2菌株所产的NADH氧化酶属与两种分类中的那一类。
（5）NADH氧化酶的固定化研究：利用纤文素包裹磁铁，高碘酸钠氧化纤文素为二醛纤文素，对NADH氧化酶进行固定，再用戊二醛进行交联，增强固定化效果，初步探究采用该方法固定NADH氧化酶的效果。
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