AHL分子荧光法检测质粒的构建(4)
③β-半乳糖苷酶活性检测法AHL诱导根癌
土壤杆菌中lacZ基因表达B-半乳糖苷酶，水解底物邻硝基苯-p-D-半乳糖苷 (ONPG)产生黄色。AHL含量越高，报告菌产生的β-半乳糖苷酶活性越强，通过检测β-半乳糖苷酶活性 间接反映AHL水平，因此，利用该法可有效检测AHL活性变化规律[1]。
1.4 传感菌检测AHL信号分子国内外研究进展
传感菌是检测AHL的有效手段，简单、快捷，不需昂贵设备，还有助于研究与真核生物的相互作用和交流。但在检测AHL时应相当谨慎，因细菌提取物中可能含非AHL化合物，可能干扰或激活报告系统给出假阳性。同样，得到阴性结果也不能完全排除待测菌不产生AHL，因可能在实验条件下产生的AHL浓度太低，不足以激活报告系统，或采用的生物感应器不适合该特异AHL[21]。因此，检测时应严格控制条件，同时应采用多个穿杆菌交叉检测。
1993年，Swift等构建了基于lux报告基因的重组质粒pSB315，该质粒缺乏luxI功能区域，只有外源AHL存在并以长链饱和醛(如十二烷醛)为底物时，携带pSB315的大肠杆菌才能发光。pSB401质粒不需饱和醛作为底物即可被A HL诱导。基于lux报告基因构建的大肠杆菌菌株只在外源AHL诱导下，luxCDA BE转录启动发光，且亮度与外源AHL浓度成正比[22]。
一些带lacZ报告基因的质粒也被转入某些细菌中，使操作更为简便。基于las报告基因的pUCP18质粒携有来自铜绿假单胞菌PAD1的lasR和一个 lasB：：lacZ融合子，对OdDHL极为敏感。基于根癌土壤杆菌构建的检测菌质粒pDCI41E33将lacZ与traG融合，traG受TraR (LuxR同系物)调控，用混有 5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-葡萄糖基吡喃糖苷(X-ga1)的琼脂覆盖培养，可在薄层层析板(TLC)或培养皿看到被检测到的AHL出现蓝色斑点[23]。
革兰阴性菌紫色杆菌(Chromobacterler vio-laceum )产生紫色杆菌素的功能可被诱导或抑制，菌株CV026是不产紫色杆菌素的最小化Tn5突变株，但在含外源AHL的基质中培养时可恢复产生紫色杆菌素，该突变株可取代基于lux报告基因构建的检测菌株。虽然l0～14个C原子N-酰基链长分子结构不能诱导紫色杆菌素产生，但在检测培养基中加入起激活作用的AHL时，抑制紫色杆菌素产生能力不同程度地被检测到，并在紫色背景下产生白色晕环。此外 ，Steidle 等基于gfp报告基因构建的检测菌株灵敏度很高，可检测到极低浓度的AHL[24]。
Zhu等在根癌土壤杆菌中构建了一株高效检测菌株KYC55 (pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)[25]闭，该菌株导入能超量表达TraR蛋白的质粒 (pT7-traR )及含有Ptral-lacZ启动子序列的报告质粒，由于TraR与自体诱导物结合后转变为活性形式并与 tra启动子序列结合，启动其转录使lacZ表达。因此，TraR超量表达可提高其与自体诱导物结合，增强lacZ报告基因的表达。用该检测菌株可对32种AHL进行检测，这些AHL具有不同测链长度、饱和度和氧化程度，该检测菌株是目前报道的具有最高敏感性、检测AHL范围最广的生物检测菌株。
目前，tral-luxCDABE传感菌[27]是将根癌土壤杆菌A136的Ti质粒剔除TraI／R的QS系统设计。报告菌株含2个质粒，即产生TraR反应调节基因的pCF218 质粒和含traI启动子融合到luxCDABE操纵子的pMV26质粒。TraR与AHL形 成AHL-TraR复合物，结合到pMV26的tral启动子特殊序列，启动luxCDABE操纵子转录，产生生物发光。TraI-luxCBE对4～12碳的酰基侧链AHL起反应，对更长侧链的灵敏性更高。
1.5 本研究的主要内容与研究的意义
1.5.1 本课题研究的主要内容
本研究主要是构建一个检测质粒并转化宿主形成传感菌，检测环境中的AHL是否达到值域。通过一对特别设计的引物，运用PCR从pLuxGFPuv2质粒（来自E.coli Top10）上扩增绿色荧光蛋白基因GFP。然后利用AatⅡ限制性内切酶切割扩增后的GFP片段和pLuxR质粒（来自E.coli XL10-Gold），并通过碱性磷酸酶对pLuxR质粒进行去磷酸化处理来防止载体的自身环化，再用T4 DNA连接酶将目的基因GFP与载体质粒pLuxR连接。接着将重组质粒导入DH5α和Top10F’感受态细胞中进行转化。最后通过PCR对所建质粒进行验证方向从而筛选出序列正确的重组质粒，质粒构建成功（见图1-1）。