AHL分子荧光法检测质粒的构建(5)
图1-1 检测质粒构建流程图
Fig 2-1 The flow chart of constructing the detection plasmid
1.5.2本实验的基本原理
群体感应涉及生物荧光、毒素的生成[12]、生物被膜、细菌浮游、质粒转移、抗生素的合成、芽孢的形成、胞外酶的形成等许多生理功能。海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）的群体感应在20世纪70年代最早被报道，并且研究最为透彻。该菌通过LuxⅠ合成信号分子N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone，AHL），这种信号分子会和其受体蛋白LuxR结合，启动荧光素酶操纵子的表达[13]。
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是来源于发光水母（Aequorea Victoria）的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，具有238个氨基酸。由于GFP的自发荧光特性，发光不需要其他的协助因子，荧光生色团对热、pH值、化学变性剂稳定，具有较强的抗光漂白作用，因而在分子生物学的众多研究领域中应用广泛，比如用于特定蛋白的标记定位、活体内的肿瘤检测、药物筛选等等[14]。
1.5.3 本课题研究的意义
近年来，有关细菌QS信号分子AHL结构与功能的研究方兴未艾，更多信号分子可能被发觉，进一步研究可能会发现或证实由QS控制的新细菌特征。在一些细菌感染中QS现象已得到证明，AHL在疾病治疗中作为生物标记已被用于早期疾病诊断和活性检测，这可能是一种非常有效的分析手段[9]。因此，建立有效、快速、准确检测AHL的方法对于深入研究细菌QS现象具有非常重要的意义。
2. 实验材料与方法
2.1 材料与仪器设备
2.1.1 菌种
表2-1.实验中的菌株及质粒
Table2-1 Bacterial strains and plasmids used in this study
菌株 质粒 相关特点 来源或参考
E.coli
Top10F ' 无质粒 无抗性 实验室提供
DH5α 无质粒 无抗性 实验室提供
117 pLuxGFPuv2（见图2-1） Kmr 实验室提供
126 pLuxR（见图2-2） Kmr 实验室提供
图2-1 菌株117质粒
Fig 2-1 Plasmid of strain117
图2-2 菌株126质粒
Fig 2-2 Plasmid of strain126
2.1.2 实验材料
此次实验主要购买的试剂及厂家情况见表2-2。
表2-2 实验试剂
实验试剂 厂家
LB液体培养基、LB固体培养基 生工生物有限公司
Biowest Agarose regular GENE TECH（SHANGHAI）COMPANY LIMITED
卡那霉素粉末 生工生物工程（上海）有限公司
PCR试剂盒 生工生物工程（上海）有限公司
引物gfp1031f 上海捷瑞生物工程有限公司
引物gfp2841r 上海捷瑞生物工程有限公司
引物pD1 上海捷瑞生物工程有限公司
AatⅡ限制性内切酶 Fermentas Life Sciences
Alkaline Phosphatase Worthington Biochemical Corporation
50×TAE电泳缓冲液贮存液 生工生物工程（上海）有限公司
小剂量质粒提取试剂盒 生工生物工程（上海）有限公司
质粒DNA小量制备试剂盒 上海捷瑞生物工程有限公司
UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限公司
SK2301一步制备感受态细胞溶液SSCS 上海生工生物工程技术服务有限公司
NormalRunTM250bp-Ⅱ DNA