海藻糖生产菌株的诱变筛选(3)
山东轻工业学院的王子辉[6]在2011年时成功的用布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)进行自然复壮和多次紫外诱变，获得布拉酵母菌高生物量及高产海藻糖菌株。以诱变后筛选出的菌株为出发菌株，对布拉酵母菌的培养基成分及其培养条件进行优化。优化后得到的培养基成分及培养条件如下：最佳碳源为葡萄糖，其最适浓度10％；最佳氮源为柠檬酸三铵，其最适浓度为0.7％；玉米浆1.5％；磷酸氢二钾0.2％。最适发酵温度为30℃；最适pH为5.5；发酵菌种培养16h接种，接种量为10％；采用摇瓶发酵时，摇床转速为200r/min，三角瓶的装液量为100mL/500mL，最适培养时间为18h。最后通过对比性实验，验证了经诱变后的菌株在优化发酵培养基中生长状态更好，生物量可达4.2g/100ml，海藻糖含量可达56mg/100ml，与实验室原有菌株在普通发酵培养基内相比，生物量提高35.5％，海藻糖产量提高了30.2％。经过菌株的诱变筛选及培养基的优化，达到了提高布拉酵母菌生物量及其海藻糖产量的研究目的。
上海应用技术学院教授荣绍丰[7]于2002年通过高效液相色谱 /示差折光检测系统 (HPLC/RI)分析可获得细菌D 97利用糊精或淀粉水解物合成海藻糖的基本生物学信息 ,包括微生物培养碳源对细菌D 97胞内海藻糖合成酶系的影响以及该酶系利用不同种类或不同分子链长度的麦芽寡糖合成海藻糖的能力及作用过程。采用HPLC与RI及电喷雾电离质谱 (ESI MS)联用并结合其他生物学手段对由细菌D 97获得的纯酶组分 (酶A)作用产物进行定量和定性分析 ,从而基本明确了D 97胞内酶合成海藻糖的过程。
国外关于海藻糖的研究则更早，Comes等分离出两个酵母菌株，它们在热击条件下大量积累海藻糖。
采用特殊的培养工艺，通过调节多种降低生长速率的因素，如营养饥饿，提高温度，干燥或冷冻等造成海藻糖的积累，导致其含量增加，这样可使酵母细胞内海藻糖的含量达其干基的15~20%。酵母中海藻糖的含量由生成和代谢的平衡调节。在海藻糖合成期间，必须使6-P-海藻糖合成酶处于活性状态，而中性海藻糖酶处于非激活态，这样才能使海藻糖的合成大于分解，有利于积累。从酵母中提取海藻糖，首先要保证细胞处于海藻糖最大积累状态，并保持不被酶所分解，这要通过多因素调控来实现，由于海藻糖积累是在碳源有限时才能出现，所以一般不存在其它单糖和双糖的干扰，在除去蛋白等大分子物质和细胞碎片以后，用乙醇抽提可以得到海藻糖二分子结晶体。
国内外对选育高产海藻糖的酵母菌种进行了大量研究。日本一家之素公司首先利用一种氨基酸生产菌工业化生产海藻糖，每公斤售价2万日元，最近在Candida sp中日本科学家用紫外线或亚硝基胍诱变获得一株海藻糖营养缺陷型菌株，产率较高。美国从酵母中提取的海藻糖，每公斤200美元。
1.2本课题的研究内容、目的及意义
海藻糖，又名覃糖，是由两个葡萄糖残基以α，α一１，１键联结而成的一种非还原性的双糖。其分子式为C12H22O11，分子量（两分子结晶水）为378.23。海藻糖在生物体内除作为结构成分、提供能量以外，最重要的作用是作为一种典型的应激代谢物，在干燥、低温、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白质、 脂类、糖类、核酸等组分不受破坏， 保护细胞免受伤害。科学家们发现，沙漠植物卷叶柏在干旱时几近枯死，遇水后却又可以奇迹般复活；高山植物复活草能够耐过冰雪严寒；一些昆虫在高寒、高温和干燥失水等条件下不冻结、不干死，就是它们体内的海藻糖创造的生命奇迹。海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而文持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜糖的功能。
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