番茄LeEIN2基因的克隆与沉默载体的构建(2)
病毒诱导的基因沉默是一种利用植物病毒载体介导的植物基因沉默的方法[5]，该方法是在对植物病毒基因组结构和植病互作机制深入了解的基础上发展而来的一种研究植物未知基因功能的有效工具。与传统的研究植物基因功能的方法相比较，该方法具有周期性短、简便高效、可以沉默基因家族和不需要对植物进行转化等特点，并且可以在物种内和物种间不同遗传背景的植物之间进行基因功能的比较[6]。国内外在番茄[7]、烟草[8]、马铃薯[9]、豆类[10]和优尔椒[11]等植物幼苗中已成功建立病毒诱导的基因沉默体系，并将其应用于基因功能的验证。本研究通过构建携带番茄EIN2的病毒诱导的基因沉默载体，为以后对番茄EIN2基因的研究奠定基础。将使我们对乙烯信号转导、环境胁迫中防卫反应及果实成熟相关基因调控的机理更加明确，同时为利用基因工程技术改良番茄品质提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料及试剂
1.1.1 实验材料
番茄品种为Moneymaker，大肠杆菌DH5α为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存，质粒pYY13由清华大学刘玉乐教授惠赠，pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。
1.1.2 主要试剂
2×Taq Master Mix、dATP、dTTP、T4 DNA聚合酶、限制性内切酶PstⅠ和cDNA合成试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；植物RNA提取试剂盒（RNApure Plant Kit）购自康为世纪生物科技有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；其它常用试剂为进口或国产分析纯。
1.1.3 主要仪器
5180R型冷冻离心机为德国艾本德（Eppendorf）公司产品，Tanon-2500型凝胶成像系统为上海天能科技有限公司产品，温度梯度PCR仪为德国Biometra公司产品，SW-CJ-2F型双人双面净化工作台为苏州净化设备有限公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 番茄RNA的提取及目的基因的扩增
以番茄（Moneymaker）的幼嫩叶片为材料提取总RNA，番茄总RNA的提取根据植物RNA提取试剂盒（RNApure Plant Kit）操作说明书进行，并通过琼脂糖凝胶电泳对其进行分析。
cDNA的合成按照cDNA合成试剂盒（TaKaRa）的操作说明书进行，合成cDNA第一链。根据已发表的番茄EIN2基因序列（GenBank登录号DQ409137），利用primer 3.0在线引物设计软件对EIN2分析设计引物（表1）。Liu E等学者的研究认为用400bp-500bp基因片段重组的病毒沉默载体侵染植株，基因沉默的效果显著[12]，故本研究所设计引物的PCR扩增产物序列大小为403bp。PCR引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
表1引物序列
N0 Oligo sequence (from 5' end to 3' end)
R
F GAGGAGAAGAGCCCTCTCATCAGCCCCATCATC
CGACGACAAGACCCTAGATGCGAGAGCTCAATG
PCR反应体系：cDNA模板2μL，上下游引物各2μL，2×Taq Master Mix 10μL，加双蒸水至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃再延伸5min。取样品5μL进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。然后大量扩增并经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。
1.2.2 pMD18-T载体与目的基因EIN2的连接反应
操作依据pMD18-T载体说明书进行。
1.2.3 感受态细胞的制备和目的基因的转化
实验操作依据分子克隆实验指南[13]。
1.2.4 重组pMD18-T-EIN2的检测与鉴定
使用高纯度质粒小量快速提取试剂盒从挑取的转化后大肠杆菌单克隆的菌液中提取pMD18-T-EIN2重组载体。分别采用重组质粒和纯水为模板进行PCR反应，所用引物及PCR条件同1.2.1。初步检测构建的重组质粒中扩增出的EIN2的部分片段大小是否与目的基因一致。
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