2。9。5转基因阳性根筛选 13

3。结果与讨论 13

3。1 GmPE70全长基因PCR扩增 13

3。2 GmPE70基因序列生物图谱 13

3。3 Sac I，Bamh I双酶切鉴定 14

3。4转基因阳性根筛选 15

4。结论 17

参考文献 18

致谢 19

引言

1。 背景意义

众所周知，大豆不仅是一种应用广泛的食品，也是一种畜牧饲料。它营养丰富富含高蛋白和核酸物质。由于国产大豆产量低，品质不高等原因，使我国每年都要向海外进口大量的大豆。

据有关数据统计，我国80%-90%的大豆依赖进口，在2012年进口大豆量为2142万吨，花费约100亿的外汇储备，且这个数据还在逐年上升当中，到2016年9月底已创下8600万吨的惊人纪录，花费400亿左右美元，相当于修建一条京沪高铁的费用。预测在2020年进口量将在1。25亿吨左右。现如今，过于依赖进口大豆，已严重危及我国粮食食品安全和社会的稳定，提高我国大豆产量刻不容缓。毫无疑问，扩大大豆的种植面积是快速提高大豆产量最有效途径之一。然而，我国可种植的耕地面积有限，用这些基本耕地来种植大豆显然是不可能。我国的盐碱地分布十分广泛[1]，土地盐碱化严重。如果能把这些滩涂、盐碱地利用起来，来扩大大豆的种植面积，必然是一个大的可发展的前景产业。论文网

目前，我们遇到的最大阻碍就是大豆不耐盐。盐碱环境对大豆最直接的危害表现在渗透胁迫上，在低渗透压环境下大豆根部吸收不到土壤中的水分，甚至还会失水，使植物枯死。当土壤中大量的盐离子[2-4]进入大豆根部，这些盐离子就会对大豆根内部的蛋白、核酸等物质正常的代谢途径造成胁迫，既离子胁迫等。当离子胁迫达到一定程度后，过氧化物大量的积累会造成细胞的过氧物胁迫，进而导致细胞的死亡[5]。

查阅已有文献发现转录因子GmPE70能够调节查尔酮合酶[6]（Chalcone synthase，GmCHS），查尔酮异构酶（Chalconeisomerase，GmCHI）以及细胞色素p450单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenase，GmCPM）启动子区的关键酶的转录表达。从而调节大豆在盐碱地的生存能力。所以本实验的目的在于如何让GmPE70 基因在大豆中过量的表达。本实验利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes）进行深入研究。

2。 农杆菌介导法

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes）是两类革兰氏阴性菌，通常大部分研究都会用农杆菌进行植物的遗传转化实验。本实验选择发根农杆菌，其含有Ri质粒(Root-inducing plasmid) 。将大豆子叶、子叶节等部分都可以作为农杆菌转化的外植体[7-9]，克隆转录因子GmPE70目的片段通过酶连接到表达载体pDL28HA-GFP，将构建好的载体转化到农杆菌中，农杆菌可以通过侵染外植体的方法将转录因子GmPE70与植物建立联系。文献综述

1。实验材料设备

1。1实验材料

植物材料：Union85140大豆

载体：a、克隆表达载体T（源于上海生工生物工程有限公司）

b、植物表达载体pDL28-RFP

菌种：a、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes）k599菌株

b、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α

1。2 实验试剂

康为世纪植物RNA提取试剂盒、康为世纪PCR产物回收试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒（源于上海索宝生物科技有限公司）、T4DNA连接酶（源于北京中生柏奥生物科技有限公司）DNA Marker和溴化乙锭（EB）、无水乙醇、胰蛋白胨、琼脂糖、核酸电泳缓冲液