2。12。 k599 介导大豆转基因，并获得大豆阳性转基因根 13

3 结果与分析 14

4 讨论与注意事项 15

参考文献 17

致谢 18

引言

1。 背景意义

众所周知，大豆不仅是一种应用广泛的食品，也是一种畜牧饲料。它营养丰富富含高蛋 白和核酸物质。随着人们生活条件的改变和经济的高速发展，我国对大豆的需求量逐年上升， 并呈现出供不应求的境况。由于国产大豆产量低，品质不高等原因，使我国每年都要向海外 进口大量的大豆。据有关数据统计，我国 80%-90%的大豆依赖进口，在 2012 年进口大豆量为 2142 万吨，花费约 100 亿的外汇储备，且这个数据还在逐年上升当中，到 2016 年 9 月底已创下 8600万吨的惊人纪录，花费 400 亿左右美元，相当于修建一条京沪高铁的费用。预测在 2020 年进口量将在 1。25 亿吨左右。现如今，过于依赖进口大豆，已严重危及我国粮食食品安全和 社会的稳定，提高我国大豆产量刻不容缓。毫无疑问，扩大大豆的种植面积是快速提高大豆 产量最有效途径之一。然而，我国可种植的耕地面积有限，用这些基本耕地来种植大豆显然 是不可能。查阅文献后，发现我国的盐碱地分布十分广泛[1]，土地盐碱化程度高且大部分是 处于闲置状态。如果能把这些滩涂、盐碱地利用起来，来扩大大豆的种植面积，必然是一个 大的可发展的前景产业。

目前，我们遇到的最大阻碍就是大豆不耐盐。盐碱环境对大豆最直接的危害表现在渗透 胁迫上，在低渗透压环境下大豆根部吸收不到土壤中的水分，甚至还会失水，使植物枯死。 当土壤中大量的盐离子[2-4]进入大豆根部，这些盐离子就会对大豆根内部的蛋白、核酸等物 质正常的代谢途径造成胁迫，既离子胁迫等。当离子胁迫达到一定程度后，它会进一步的使 电子传递链、光合作用、呼吸作用等电子传递链受到影响，在这些途径中产生的过氧化物类 物质不能被进一步的消耗，过氧化物大量的积累会造成细胞的过氧物胁迫，进而导致细胞的 死亡[5]。过氧化物胁迫是我们盐胁迫当中最严重的一种危害，也是开发盐碱地扩大大豆种植 面积的最大的障碍。

查阅已有文献发现转录因子 GmMYB176 能够调节查尔酮合酶[6]（Chalcone synthase， GmCHS），查尔酮异构酶（Chalconeisomerase，GmCHI）以及细胞色素 p450 单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenase，GmCPM）启动子区的关键酶的转录表达。从而调节大 豆在盐碱地的生存能力。所以本实验的目的在于如何让 GmMYB176 基因在大豆中过量的表 达。通过基因克隆、载体的构建在 GmMYB176 基因的启动子上游连接 35S::GmMYB176 ， 使基因具有超表达能力。

2。 农杆菌介导法

查看文献时发现发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes）和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)是两种革兰氏阳性菌，常用于改变植物的一些遗传性状。其中，根癌农杆菌中含 有一种与肿瘤诱导有关的质粒(Tumor-inducing plasmid)，简称为 Ti 质粒，可使被侵染植 物的根、茎产生肿瘤。Ri 质粒存在于发根农杆菌可以使被侵染的植物产生发状根。在大豆 叶片(叶盘法)、子叶、子叶节、下胚轴等都可以作为农杆菌转化的外植体[7-9]。大豆基因组中 存在 GmMYB176 基因但其表达量少，通过 RT-PCR 技术将 GmMYB176 基因大量扩增并用 T4 连接酶与表达载体 pDL28HA-RFP 连接，即 pDL28-35S::GmMYB176 /Ubq10::RFP 具有过 表达能力，将其转化到农杆菌中，通过农杆菌侵染外植体的方式使转录因子 GmMYB176 在 大豆中过量的表达。