3。 研究的基本内容

（1）构建 pDL28HA-MYB176-RFP 载体[10]。源Y于U优I尔O论P文W网wwW.yOueRw.com 原文+QQ75201-8766

（2）以发根农杆菌 k599 介导大豆转基因，并获得大豆阳性转基因根。

（3）将阳性转基因根在盐碱环境中进行盐胁迫处理，观测表型，并分析相关生理生化指标。

1。 研究材料与试剂

1。1。  实验材料

大豆 Union85140 品种。

1。2。 质粒载体与菌种

大肠杆菌(Escherichia coil)菌株 DH5α来自本实验室保存、pMD18-T vector 载体、表达载 体 PDL28-HA、农杆菌 k599。

1。3。  实验试剂

酵母提取物、蛋白胨、氯化钠、Agar、牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸镁、

Amp、Kan、X-Gal、IPTG、液氮、三氯甲烷、异丙醇等。

康为世纪 HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit HiFiScript cDNA 第一条链 合成试剂盒 cw2569、康为世纪 RNApure Plant Kit（DNase I）、限制性内切酶、T4 DNA

polymerase  购于 TARAKA；NaCl  购自上海生工；Yeast Extrac（t  酵母提取物）购于 OXOID；

Agar B 购于生工；琼脂糖购于 BIOWEST；DNA Marker 购于 BIOMED；High Pure PCR Product Purification Kit；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有 限公司；Qiagen 试剂盒。

1。4。  培养基

1）LB 固体培养基：酵母提取物 20g/L，琼脂 12~15 g/L，高温灭菌。

2）FM 液：A 溶液 1000 X（MnSO4·7H2O，24。64 g/200ml）、B 溶液 1000 X （KH2PO4，

19。06g/200ml）、C 溶液 500 X（NaH2PO4·7H2O）、D 溶液 400 X（FeSO4·7H2O，1。12 g/200 ml；Na2EDTA，1。48 g/200 ml），E 溶液 1000 X（CaCl2·2H2O），F 溶液 1000 X（MnSO4、 CuSO4、H3BO3、NaMoO4 五种药品先分别称取 0。5 克溶解，之后混匀在 1 升水中，从中取出

1 毫升稀释 1000 倍备用。），ABCDEF 六种液体按一定的比例混合而成的集合，称为 FM  液。

3）FM 培养基：FM 液/L+12 g 琼脂/L。

4）FM 生根培养基 1 L：FM 液/L+15 g 蔗糖+12 g 琼脂+双蒸水定容。

5）63 号培养基：蔗糖 10 g/L，K2HPO4    g/L，NaCl0。1 g/L，酵母提取物 1 g/L，MnSO4·7H2O，

1。2 g/L，MnSO4 1ml/L，H3BO4 1 ml/L，NaMoO4 1 ml/L，柠檬酸铁 1 ml/L，CaSO4·2H2O 1 ml/L。 6）SOC 培养基 g/L：一蛋白胨 20 克，酵母浸粉 5 克，氯化钠 0。5 克，氯化钾 0。186 克， 氯化镁 0。95 克，硫酸镁 1。2 克，葡萄糖 3。6 克，pH 值 7。0±0。2。来自优Q尔W论E文R网wWw.YouERw.com 加QQ75201.8766

以上培养基菌需要在 121  ℃，20 min 高温灭菌备用。

1。5。  主要仪器

电热恒温振荡水槽（上海森信 DKZ-450B 型）、摇床（New Brunswick Scientific）、 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏 DHG-9123A 型）、单人净化工作台（苏州净化 SW-CJ-ID 型 ） 、 高 速 离 心 机 （ Eppendorf centrifuge5418 ） 、 高 速 台 式 冷 冻 离 心 机 （ Eppendorf centrifuge5810R ） 、 PCR 仪 （ Applied Biosysterms 2720Thermal Cycler&Long Gene A200Gradient Thermal cycler）、荧光定量 PCR 仪（AppliedBiosysterms StepOnePlus）、电 泳仪（Amersham Biosciences EPS601）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、 -20  ℃ 低温冰箱

（Electrolux BCD-235F）、-80  ℃ 低温冰箱 (SANYO MDF-U32V)、体式荧光显微镜。

1。6。   PCR[11]扩增引物列表

引物名称Primer name

所用引物列表表格 1引物序列Primer sequence (5'一 3')

OEMYB176-F OEMYB176-R

CGAGCTCATGTCTCGCGCCTCTTCC