微卫星(microsatellites)也被称为简单序列重复(simple sequence repeats,SSR),它的组成部分是由一类的由几个核苷酸(1-5个)的DNA序列,这几个核苷酸是为重复单位组成的长达几十个核苷酸,较短的长度,在染色体上广泛分布 [2] 。之所以它是一种十分理想的分子标记,是因为它具有较高的多态性、共显性、用(PCR)检测时简单方便和稳定可靠的结果等特点。造成SSR长度具有高度的变异性的因素有两个方面:第一个是不完全相同的重复程度,第二个是重复单位的次数不同。正因为SSR具有高度的变异性,所以被用于构建作物品种的标准指纹,也被认为是最有希望的分子标记之一。SSR能使用微卫星区特异性序列设计引物,通过PCR进行扩增,琼脂糖凝胶进行电泳,从而显示出不同个体之间SSR基因座的多态性,是因为它的序列的两端一般都是保守的单拷贝序列,即使它们在基因组上的SSR位置不同。
作物品种鉴定是农业生产中重要的、不可缺少的步骤。作物品种鉴定之所以成为一个最重要的环节,是因为它有很多的优点:1)能充分的发挥优良品种所带有的优异遗传性状;2)防止了品种的退化;3)使农业生产的高产量和稳定产量得到提升;4)种子的质量得到稳定的提高;5)也阻止了品种因为多而混乱的状况[3]。通过构建大麦的SSR图谱,对研究大麦亲本材料的遗传多样性,寻找与部分农艺性状相关联的分子标记,为组合大麦杂交的配置及分子标记辅助育种提供依据[4]。
分子标记技术现在已经被广泛应用于大麦的遗传多样性研究,是因为随着分子生物学技术的发展,分子标记种类及检测手段的逐渐完善。目前,GrainGenes2。0网站(http:// wheat。pw。usda。gov /GG2/index。shtml)公布的有1000多个大麦SSR标记,也为分子技术的研究上提供了强有力的基础。论文网
关于如何使用SSR标记技术来分析大麦遗传多样性的差异,在国内外已经有很多的报道。Matus等使用22个SSR标记分析147种代表性大麦材料的遗传多样性,包括品种、遗传图谱和核心种质。共检测到687个等位基因,品种和地图多样性丰富。Brantestam等[5]对北欧和波罗的海区域的197份春大麦进行了遗传多样性研究,也是充分利用了22个SSR标记技术,使他们成功的检测出了191个等位变异,平均每个标记检测的变异在2-23个,研究表明,当今栽培种的遗传多样性有了一定的变化,与早期品种相比,这种遗传的多样性越发的明显了,也带动了一些起源地材料发生了改变。Sun等[6]也将研究指向了中国西藏野生大麦及世界各起源地的部分大麦材料,充分的利用42个SSR标记进行了遗传多样性研究,也对14个数量性状进行了关联分析。
本实验重点对51份欧洲大麦亲本材料进行了遗传多样性 [7]分析,构建相对应的指纹图谱,从而确定大麦亲本材料间的遗传背景差异,也为后期的一系列育种工作中提供了有价值的参考。
1、材料与方法
1、1材料
1、1、1 实验材料
在本实验中,从欧洲大麦种质资源中获得了51份样品,提取DNA,直到DNA完成提取。
1、1、2 实验试剂
本实验所用试剂包括氯仿、蒸馏水、异戊醇、75%酒精、琼脂糖、TBE、核酸染料、loading buffer。
1、2 方法
1、2、1 DNA提取和PCR扩增
DNA提取:采用CATB的方法:①样品加CTAB(氯仿:异戊醇=24:1)750μL剧烈摇一下,水浴65℃(40-45min); ②加入500μL氯仿后,快速剧烈摇晃使之均匀,在桌面静放5-10min,12000rp离心8min 后,弃废弃物取上清液; ③加入等体积(500μL)异丙醇,轻轻颠倒多次,放置4℃内半个小时;④12000rp离心6min弃上清液取沉淀物,用75%酒精洗DNA,并晾干; ⑤加150μL ddH2O放置于4℃保存。