外生菌根真菌（EMF）耐铬的生理与分子机制研究(3)
1.2.2.2液体培养
本实验Cr浓度梯度设计为：0mg/L，5 mg/L，20 mg/L。1.2.1中筛选出的耐铬菌株与敏感菌株备用。分别制备上述3个浓度处理的液体培养基，每个处理各取20ml培养基分别装入25ml三角瓶中。每瓶分别接种一块1.2.2.1中活化好的直径为6.5mm的固体菌块，暗箱25℃培养。先进行3天的预培养，并在预培养后的2天、4天、8天分别加Cr并提取菌液经0.22um微孔滤膜过滤后进行后续生理生化指标的检测。收集培养8天后的菌块进行鲜重和干重的测量，记录数据并对各处理之间生长状况进行对比。每个处理设4个重复
1.3探究EMF对Cr的吸收与还原能力
1.3.1菌液与样品液的配制
菌液取自1.2.2.2液体培养的菌液过滤液。样品溶液分为质外体中的交换态Cr溶液和胞内Cr溶液。
1.3.1.1质外体中的交换态Cr溶液
液体培养8天的样品过滤后取菌丝，用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干表面水分后将菌丝放入50ml离心管中，加入20 ml 0.05mol/L的CaCl2, 震荡30min（50rpm/min），过滤，滤液定容至25ml，避光低温保存。
1.3.1.2胞内Cr溶液
取用1.3.1.1过滤后的另一份菌丝，按每300mg湿菌丝加1ml酶液（以0.6 mol/L的KCl配制的1% 蜗牛酶和破壁酶），30℃水浴酶解3h。用灭过菌的4层擦镜纸过滤，滤液3000r/min离心10min，弃上清收集沉淀，用0.6 mol/L KCl洗涤两次，然后将原生质球转入10ml去离子水中，避光低温保存。
1.3.2总Cr的测定
利用原子吸收光谱仪测量菌液和样品液内的总铬含量。
1.3.3 Cr(VI)含量的测定
1.3.3.1铬标准溶液
配置铬浓度为1μg/ml的K2Cr2O7标准溶液（当天配置）。
1.3.3.2含混酸DPCI溶液配置
称取0.2g二苯碳酰二肼,溶于50ml丙酮中，移至100ml容量瓶，加水定容，摇匀，4℃制冷。再向制冷液中依次加入12.5ml浓硫酸和5ml浓硝酸，边加边搅拌。混匀后贮存于棕色瓶4℃避光保存。
1.3.3.3标准曲线绘制
在6个50ml容量瓶中，用移液管分别加入0、0.2、0.5、0.8、1.0和2.0ml的1.0μg/ml铬标准液，先加水定容，每个容量瓶中再加入3ml含混酸DPCI溶液，立即摇匀，静置5min。用分光光度仪，以蒸馏水为对照，在540nm处测量吸光值。
1.3.3.4样品液中Cr(VI)含量的测定
取5ml样品液于50ml容量瓶中定容稀释，每个容量瓶中再加入3ml含混酸DPCI溶液，立即摇匀，静置5min。用分光光度仪，以蒸馏水为对照，在540nm处测量吸光值。
1.4 Cr处理后菌液pH的变化
实验处理同1.2.2.2,。先进行3天的先期培养，并在先期培养后分别培养的2天、4天、8天分别加Cr并提取菌液进行pH的测定。
1.5 Cr对EMF分泌低分子量有机酸的影响
利用高效液相色谱仪对过滤后的菌液进行有机酸种类与含量的测定，记录数据并根据其变化分析结果。
1.6 Cr处理前后有机酸分泌关键酶活性的检测分析
利用1.2.2.2所得菌块对调控有机酸分泌的关键酶的活性进行检测。
粗酶液提取：将菌块置于预冷的研钵中，加入5ml预冷的pH 7.0磷酸缓冲液，于冰盒中研磨至匀浆状。然后用4℃离心机，10000r•min-1离心15min，留取上清用于测定相关酶活性。
1.6.1 苹果酸脱氢酶活性的测定：
在比色皿中加入pH 7.0磷酸缓冲液2.6 ml，3.75 mmol•L-1 NADH 0.2ml，6mmol•L-1草酰乙酸 0.1 ml，酶液0.1 ml，于25℃下340nm处测定NADH的吸光值下降幅度。隔1min读一次数，共读4次。酶活性用单位时间的吸光值降幅表示（ΔAmin-1g-1）[5]。
1.6.2 柠檬酸裂解酶活性的测定：
取4支试管，分别加Tris-HCl缓冲液1ml、150μmol•L-1 MgSO4 2ml、60μmol•L-1半胱氨酸盐酸 0.2 ml、酶液0.2 ml。在30℃恒温水浴中保温10 min后，将其中两支试管设为对照组，先各加入10%三氯乙酸0.2 ml，再加入7 mmol•L-1异柠檬三钠 0.2 mol。另两只试管为实验组，各只加入7 mmol•L-1异柠檬三钠 0.2 mol。将所有处理于80℃恒温水浴中反应30 min后，往实验组试管中立即加入10%三氯乙酸0.2 ml，终止酶促反应。用离心机3000 r•min-1离心5 min，吸取1ml上清液于5ml Ep管，并加入 0.1%二硝基苯肼 0.2 ml，在80℃恒温水浴中保温 30 min，最后加入1.5mol•L-1 NaOH 2ml显色。另取Tris-HCl缓冲液1ml、0.1%二硝基苯肼0.2 ml和1.5 mol•L-1 NaOH 2ml做空白对照。在波长445nm下进行比色，记录光密度值。用实验组的光密度值减去对照组的光密度值，求平均，并根据校正后的光密度值用乙醛酸标准曲线求得相应乙醛酸含量。酶活单位可用30℃酶促反应下，每分钟催化裂解1 mmol•L-1异柠檬三钠为1个酶活单位表示[5]。