Fluralaner对二化螟的毒力测定及其靶标受体的克隆分析(2)
1.2 主要试剂 5
1.3 主要仪器设备 5
1.4 其他材料 5
2 试验方法 6
2.1 二化螟总RNA的提取 6
2.2 cDNA第一条链的合成 7
2.3 二化螟GABA受体cDNA序列的克隆 7
2.4 PCR产物回收与纯化 8
2.5 目的DNA的连接 8
2.6 连接产物的转化及扩大培养 8
2.7 阳性克隆的检测 8
2.8 菌液PCR验证 9
2.9 二化螟GABA受体亚基基因的RACE克隆 9
2.10 End-to-end PCR 验证 10
3 二化螟GABA受体LCCH3亚基的生物信息学分析 10
3.1 序列的一级、二级结构分析 10
3.2 进化树的构建 10
3.3 跨膜区预测 11
4 结果与分析 11
4.1 片段克隆 11
4.2 生物信息学分析 12
5 讨论 15
致谢 15
参考文献 16
Fluralaner对二化螟的毒力测定及其靶标受体的克隆分析
二化螟（Chilo suppressalis Walker）是一种重要的钻蛀性水稻害虫，在我国水稻种植区分布广泛，是大部分稻区的螟虫优势种。随着我国耕作制度和水稻品种的改变、全
球气候的变暖，二化螟的生存环境得到极大改善，种群数量显著上升[1]。以二化螟为主
的水稻螟虫成为继20世纪80年代稻飞虱、90年代棉铃虫之后又一严重威胁国计民生的
重大害虫[1]，对我国水稻生产造成严重威胁。由于生产上长期大面积地使用单一农药，二化螟的抗药性问题日益突出。研究二化螟的抗药性机理、开发研制新型农药与及时调整用药策略对于解决二化螟的抗药性问题显得尤为重要。
Fluralaner是一种新型异噁唑啉类杀虫剂，主要通过干扰GABA门控氯离子通道发挥作用[2, 3]。GABA是动物体内一种主要的抑制性神经递质，通过与GABA受体结合，抑制神经信号传递，造成突触后膜的超极化，从而抑制动作电位的产生[4]；它的异常可以造成昆虫神经功能失常或昆虫的死亡。昆虫GABA受体分子结构上存在众多药物的作用位点，是良好的杀虫剂选择性靶标，已日渐成为杀虫剂毒理机制研究的重点。然而，与乙酰胆碱酯酶和钠离子通道等作用靶标相比，已开发的以GABA受体为靶标的杀虫剂品种较为匮乏。因此，fluralaner的研发不仅丰富了杀虫剂品种、促进了害虫抗药性的治理，而且开创了一类全新的GABA 门控氯离子通道干扰剂。
Fluranlaner在作为兽医用药用于防治寄生虫方面得到了较为广泛的应用，然而作为
农用杀虫剂和医药的研发方面尚且处于起步阶段[5]。Fluralaner对二化螟的毒力测定将有益于明确fluralaner对二化螟的活性，加之已有研究表明fluralaner具有杀虫活性高、见效快、作用广谱且对哺乳动物低毒或无毒等特点[5]，将其作为潜在药剂进行开发利用，对于解决二化螟的抗药性问题具有重大意义。
第一章 二化螟的饲养
1 饲养方法
水稻二化螟的室内大量饲养主要包括人工合成（或半合成）饲料饲养法和水稻种苗饲养法[6]。本实验采用水稻种苗饲养法，即利用生根发芽的水稻幼苗饲养二化螟幼虫。
2 饲养条件及用具
饲养条件：温度控制在28℃左右，相对湿度80%左右，光周期为16L：8D，光照强度>2 000 lx[7-9]。
饲养用具：恒温箱、养虫瓶、产卵箱、注射器、温度计、加湿器、塑料盆等。
3 饲养过程