表4 梨Metacaspase同系基因的特征分析9
 
梨石细胞形成和Metacaspase基因的关系   ‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)是一种驰誉中外的梨品种,因为出产于安徽省砀山县而得名,该品种梨个大核小,皮薄汁浓,果皮黄亮,果肉呈乳白色,口感较粗,有淡淡的清香。‘砀山酥梨’不仅含有丰富的营养成分,还有独特的食疗功效。近年来,由于品种逐渐退化以及栽培管理技术不到位等原因,梨石细胞含量增多,导致果肉质地变粗,口感多渣,对果实品质造成了严重的影响。因此,关于梨果实石细胞形成机理的研究,对于改善我国梨品质具有十分重要的意义。
    梨果实石细胞是一类强烈木质化的细胞[1],其含量、大小和密度都是影响果实品质的重要指标,石细胞的形成发育会受到生理因素、基因、环境等因素的调控。果实发育过程中木质素发生沉淀,从而形成石细胞。近年来,国外各方面的研究表明木质部和导管分子的形成[2-3]等都可诱导植物细胞发生细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD),植物PCD同植物细胞的木质化等密切相关。活性氧( reactive oxygen species,ROS )是诱导PCD的一个重要信号分子,氧化胁迫诱导的植物细胞 PCD与相关代谢过程的蛋白相关。Metacaspase是植物PCD发生过程中普遍存在的一类蛋白酶,利用Caspase抑制剂的生化方法和转基因研究亦证明Metacaspase蛋白酶参与了植物PCD的调控[4],其很有可能是PCD核心机制的一部分。本研究以‘砀山酥梨’为材料,对果实发育过程中不同时期的石细胞、木质素和过氧化氢含量进行测定,分析梨果实石细胞形成过程中生理因素可能存在的作用,并克隆与梨石细胞形成有关的Metacaspase基因,讨论石细胞PCD与木质化关系以及植物Metacaspase在PCD中的可能作用,旨在为探索调控石细胞形成发育的关键基因提供一定的理论依据,针对梨品质下降的现实问题,提出选育培养良种梨的相关建议。
1  材料与方法
1.1  试材及取样
    试验材料为‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’),选择树势健壮,栽培管理相同的果树,依据陶书田等[5]的方法对梨果实发育过程中石细胞团发育规律进行研究,从梨盛花期正常授粉后15d至果实膨大期,根据果实发育状况每隔7d采一次样(果实发育前期为5~6d)。每次采集果实20个(幼果适当多采),当天用冰袋保存由试验田带回实验室,样品清洗去皮将果肉削成片,经液氮速冻后装袋于-20℃冰箱中保存备用,留一部分直接进行RNA的提取。
1.2  不同时期梨果肉中石细胞含量的测定
    石细胞的分离采用冷冻分离[6]和盐酸处理[7]相结合的方法。取大小基本一致的果实3~4个,削皮,仅采用果肉部分,按四分法取样,称取100g样品,并置于-20℃低温冰箱冷冻。24h后取出样品放置室温解冻,加入200mL蒸馏水,并用组织捣碎机(1000~1500 r•min-1)持捣碎3min,将匀浆完全转移到1000mL的烧杯中,加入700mL蒸馏水,用玻璃棒均匀搅拌1min,之后再静置3min,使石细胞充分沉降,然后倾出上层悬浮液,取下层沉淀物悬浮于0.5mol•L-1盐酸中30min,弃去漂浮物,沉淀用蒸馏水洗涤。共需漂洗5~6次,将前两次漂洗倾出的上层悬浮液收集,进行二次漂洗。合并所有收集到的石细胞,用粗滤纸过滤,最后分离得到纯净的石细胞,置于烘箱中烘干至恒质量,称重。
1.3  不同时期梨果肉中木质素含量的测定
     梨木质素含量测定参考 Klason方法。取处理好的梨果肉薄片烘干,研磨成均匀粉末,过筛(200目);甲醇抽提后烘干,取0.2g干粉,用15mL72﹪H2SO4在30℃下抽提1h,加入115mL蒸馏水持续煮沸1h,加热时要注意保持总体积不变;将充分反应的混合液过滤,量取500mL热水反复冲洗滤渣,至冲洗液呈中性,收集洗干净的滤渣,所得到的木质素烘干后称重。
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