梨石细胞形成和Metacaspase基因的关系(3)
1.4 不同时期梨果肉中过氧化氢含量的测定
参照林植芳等[8-9]的方法。取0.5g样品，加入石英砂，按1：4的比例加入冷丙酮并研磨成匀浆，在4℃下（3000r•min－1）离心10min，取0.5mL上清液，加入0.5mL丙酮，再加入5%硫酸肽和浓氨水，静置，待形成沉淀后，离心（3000r•min－1 ）10min，弃上清，沉淀用丙酮洗涤后加入2mol•L－1硫酸5mL，定容并与标准曲线比色，计算过氧化氢含量。过氧化氢与硫酸钛形成过氧化物，被H2SO4溶解后在415nm波长下比色测定。标准曲线的制作步骤同上。
1.5 梨果实细胞死亡基因筛选及克隆
1.5.1 Metacaspase基因序列收集和特征分析
从Pfam上下载Peptidase_C14的结构域PF00656，用HMMER3搜索到了桃，梅，苹果，草莓，梨这五种蔷薇科物种的全部Metacaspase基因序列，共发现了78个序列，用blast局部序列比，删除了21个序列。然后根据E值的大小，以及通过SMART检测是否有完整结构域，筛选出51个基因，其中，梨有12个基因，苹果存在20个，桃存在7个，草莓存在6个，梅也存在6个。然后通过ProtParam进行梨Metacaspase的氨基酸组成成分和理化性质分析， 在线计算氨基酸序列的物理和化学性质，其中指标包括：氨基酸长度、相对分子量、理论等电点等。其中，搜索到的梨Metacaspase同系基因