1 材料与方法

1。1 实验材料

烟草品种为黄苗榆，携带质粒pRI101-AN-orf3基因的根癌土壤杆菌由本实验室保存。

1。2 转orf3基因烟草的普通PCR检测

1。2。1 转orf3基因烟草植株DNA的提取 

本实验用的是上海Sangon生物公司的植物基因组DNA抽提试剂盒，具体方法如下：（1）取50-100 mg新鲜植物组织用液氮研磨成粉末，转移至1。5 ml离心管中。（2）然后一次加入400 µl Buffer PCL，于振荡器上混匀，再加入8 µl β-巯基乙醇，于振荡器上混匀。65°C水浴45 min至样品完全裂解。（3）加入200 µl Buffer PP，充分颠倒混匀，-20°C冰箱放置5 min。（4）在室温条件下10,000 rpm离心5 min，然后取上清液加入到一个新的1。5 ml 离心管中。（5）向离心管中加入500 µl的氯仿，上下颠倒数次使其混合均匀。在室温的条件下12,000 rpm离心5 min，然后取上清液加入到一个新的1。5 ml 离心管中。（6）向离心管中加入体积与原液体相同的异丙醇，上下颠倒数次使其混合均匀，室温条件下放置2-3 min。在室温下10,000 rpm离心5 min，去掉上清液。（7）加入1 ml 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10,000 rpm离心2 min，弃上清。再重复此步骤一次。（8）开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发。（9）得到的DNA用50-100 µl TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20°C保存。

1。2。2 PCR扩增反应及产物鉴定论文网

根据orf3基因序列（GenBank登录号NC_002575）设计扩增orf3基因的引物orf3:G-P1: 5’-gcggatccacaatgtttgcgtgcaagg-3’和orf3:G-P2: 5’-gacccgggataatgtcctatcaattaagccaaataca-3’。进行PCR扩增反应。扩增反应体系见表1。

表1  PCR反应体系

Table 1  PCR amplification system

Ingredient（成分） Volume（体积）(µL)

ddH2O 23。5

10×Buffer (15 mmol/L Mg2+) 3。5

dNTP (2 mmol/L) 2

Primer 1 (10 pmol/µL) 2

Primer 2 (10 pmol/µL) 2

DNA template (50-100ng/ul) 1

Taq DNA polymerase (5 u/µL) 1

Total 35

PCR反应程序：94℃变性5 min，按94℃ 45 sec，55 ℃ 45 sec，72℃ 90 sec的循环设置30次循环，循环结束之后，在72℃下延伸10 min，后在4℃保存备用。

PCR产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶上,电压90V下，进行电泳电泳,用溴化乙锭染色，利用凝胶成像系统仪进行观察，摄影并保存。

1。3 DNA的酶切、电泳

（1）用常见的限制性内切酶（EcoRI）进行酶切，取总DNA 2。5-3 µg ，8U的限制性内切酶，特异的酶切缓冲液1。7 µl ，用ddH2O使总体积为17 µl ，37℃酶切过夜。（2）取2 µl 酶切反应混合液进行电泳检测， 当酶切完全后进行酶切片段的电泳分离。在浓度为0。8％琼脂凝胶上，电压40V下，进行电泳。待溴酚蓝指示带到达前缘后停止电泳。 

1。4 DNA的southern转移文献综述

 （1）用0。2 mol/l HCl变性8分钟。（2）将凝胶中的酶切片段转移至Hybond N＋上，转移液选择0。4 mol/l NaOH （大约24 h）。（3）将膜用2×SSC洗2次，每次5 min，置于干净滤纸上晾干，晾干的膜于已预热至65 ℃左右的干燥箱中烘干（约3 h），或紫外照射3 min。保存于4℃备用。

1。5 探针的制备

探针的制备和杂交筛选均用Roche公司的DIG-High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit Ⅱ。具体操作步骤如下：（1）使用orf3-P5：5'-cgcccaggtccaaatttgaa-3'和orf3-P6：5'-cattttcgagggagaaggcg-3'的引物从质粒pRI101-AN-orf3扩增长度为459bp的DNA片段， 扩增出的产物用上海Sangon公司DNA分离试剂盒进行纯化，再用Roche公司高效地高辛DNA标记试剂盒（DIG High Prime）制备探针。（2）取1 µg DNA加dd H2O定容至16 µl。即取5 µl浓度为0。2 µg/ µl DNA，加入11 µl ddH2O，混匀后，稍离心，在94-100℃变性10 min，变性结束后立即置于冰上，冷却3-5 min，随后加入4 µl试剂盒中标记探针的混合物（Vial 1），混匀后，稍离心。（3）在37℃中保温反应1 h至过夜，尽量长些。