利用CRISPR/Cas9技术定点突变拟南芥CRWN3基因(2)
，对人类认识植物起到了促进作用，为改良植物性状、创造更符合人类
需求的植物提供了理论支持和技术借鉴。
基因组编辑技术是基因功能研究的较好手段，而高效率、高特异、较灵活的
CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated
systems)系统更是可以广泛应用于基因功能研究，通过敲除基因进而为基因功能研究给
出最直接的证据。另外，CRISPR/Cas9 系统是基因组水平的编辑，与 RNAi 相较，又具
有完全敲除表达、可遗传的优势[3]。特别是用于关键基因功能研究的单基因完全敲除，
通过设计替换sg RNA，基本上所有的基因都可以被敲除[4]，实现对其功能的研究。 CRISPR/Cas9 是一种广泛存在于细菌和古生菌的适应性病毒防御系统。在自然界
中，当病毒侵入这些原核生物个体时，CRISPR 系统表达 Cas 蛋白和与病毒基因组互补
的guide RNA，guide RNA引导Cas 蛋白结合到对应病毒基因组切割 DNA，进而抑制病
毒，从而起到防御作用[5]。 在自然界 CRISPR/Cas9 系统的基础上，众多研究团队对 CRISPR/Cas9 系统进行了
改造，现今最为广泛应用的是将 cr RNA 和 tracr RNA 融合改造形成的 chimeric single
guide RNA（sg RNA）CRISPR/Cas9 体系拟南芥作为生长周期短的模式植物，按照以前研究的结果，通过基因组编辑技术获
得纯合突变体至少也需要 3 个完整的世代。CRISPR/Cas9 系统含有转录后相互独立的
Cas9 核酸酶和决定编辑特异性的 sg RNA。所以在基因/位点敲除方面， CRISPR/Cas9 系
统将具有其他任何基因组编辑技术无以比拟的绝对优势[7]。
本实验室其中一个研究课题是探索 CRWN3 蛋白调控拟南芥基因组 DNA 甲基化模式
的分子机理，因 CRWN 家族有四个成员，即 CRWN1、CRWN2、CRWN3、CRWN4，它
们都被认为是核片层蛋白的重要组成成分[8]，因此需构建CRWN 基因的突变体，以真正
理解它的功能，而本课题为利用 CRISPR/Cas9 系统构建 CRWN3 的单突变,CRWN3 为
AT1G68790。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 拟南芥材料
拟南芥野生型种子（Columbia ecotype，Col）为本实验室保存。
1．1．2 实验菌株
大肠杆菌 (Escherichia coli) 菌株DH5α由本实验室保存；
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 GV3101 由本实验室保存。
1．1．3 克隆载体
大肠杆菌 AtU6-26SK；
大肠杆菌 35S-CAS9-SK；
植物表达载体 Pcambia 1300。
1．1．4 实验仪器设备
PCR 扩增仪(Bio-Rad)，恒温摇床，恒温培养箱，低温高速离心机(日立)，超净工作
台，-80 ℃冷冻冰箱，-20 ℃冷冻冰箱，4 ℃冰箱，电泳仪，分析天平，分光光度计，
微量移液器，pH计等。 1．1．5 实验培养基和试剂的配制
（1）MS 培养基(1 L)：将 800 mL左右的 ddH2O置于1 L烧杯中，加入 4.43 g MS 粉
和20 g蔗糖，充分搅拌，定容至 1 L，用 0.5 M NaOH调节溶液 pH 为5.80-5.85之间，
加入7.3 %的琼脂粉后，进行 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。灭菌后待冷却到约 60 ℃时
倒皿。
（2）营养土的配制：将蛭石与黑土以一定比例(本实验室采用约 4:1 的比例)混合，
充分搅拌混匀后，放置在 100 ℃烘箱中烘 4 h，放置冷却后再使用。
（3）1 M Tris-Cl 缓冲液(pH 8.0，1 L)：取121 g Tris 置于烧杯中，加入约 700 mL去
离子水，充分搅拌后发现 Tris 不溶解，需要加入浓 HCl，同时调 pH到8.0后定容至 1 L，
分装后高压灭菌。
（4）0.5 M EDTA 溶液(pH 8.0，1 L)：将 186.1 g Na2EDTA·2 H2O加入到约 800 mL