EHA105 均由本实验室保存。水稻转基因所使用的双元表达载体pCAMBIA1300 由本实验室保存，克隆载体pMD19-T 购自于TAKARA 公司。

2。1。3  实验试剂

DNA 限制性内切酶（NEB 公司产品），T4 DNA 连接酶（Thermo Fisher Scientific

公司产品，货号00296750），RNA 提取用试剂Trizol（ Invitrogen 公司产品，货号87704），逆转录酶M-MLV 和SUPERSCRIPT III（Invitrogen 公司产品，货号1189864），PCR 产物纯化及胶回收试剂盒（Omega 公司产品，货号D6492-02/D2500-2）。

2。2  实验方法

2。2。1  材料种植

水稻种子在用水浸泡2~ 3天后，待种子萌发露白后播种于秧田的苗床上，待长到4叶

期时开始分单株移栽到北京的昌平农场或者海南的陵水农场大田中，按常规方法管理。

2。2。2  表型鉴定

  以野生型水稻日本晴 为对照，对突变体进行表型分析，取样、观察并且照相。

2。2。3  减数分裂染色体DAPI染色观察

(1) 收集时期适当的幼穗，用卡诺固定液 (3:1 无水乙醇：冰醋酸)进行固定，若长期观察，则应保存于-20ºC。

(2) 将花药取出置于载玻片上，加一滴醋酸洋红，用解剖针针尖迅速将其捣碎并在相差显微镜下观察，以挑选合适时期的花粉母细胞。

(3) 选取处于适当时期的载玻片，再加一滴醋酸洋红后，盖上盖玻片并轻压盖玻片；

(4) 酒精灯火焰上稍许烘烤后，将载玻片一侧稍许垫高并在盖玻片一侧加适量45%醋酸，而在另一侧放置一张大小合适的毛边吸水纸，并利用其将载玻片上的醋酸洋红吸净，45%醋酸的加取应保持少量多次，不仅要防止样品的干燥也要防止过量醋酸导致花粉母细胞的洗脱。

(5) 将载玻片在酒精灯火焰上烘烤后压片。文献综述

(6) 将载玻片在液氮浸泡10-20秒，用刀片迅速揭去盖玻片晾干；

(7) 每张载玻片滴加约10μl DAPI (4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色液，盖上盖玻片，压片后在荧光显微镜下观察拍照。

2。2。4  亚细胞定位

本实验所用到的亚细胞定位的载体为pJIT163-PEG，该载体通过通过35S 启动子驱动目标基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达，实现目标基因的亚细胞定位。扩增MS4基因的编码区序列（不包含终止密码子TAG），并用Hind III 和BamHI 双酶切，回收产物与同样进行双酶切的pJIT163-PEG 载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行质粒提取，经酶切、测序验证后用于后续转化试验。