本实验所采用的Wolffia属浮萍是一种单子叶植物，属于浮萍科无根萍属水生植物，亦称芜萍。为了进一步区分浮萍的种类，对其形态上的差异用分子的手段进行比较，通过改进的CATB法抽提浮萍的基因组DNA，根据5S rDNA的高度保守区设计引物[6]，PCR扩增出两个5S rDNA之间的非转录间隔区（NTS），将PCR产物连接到pMD19载体上，采用BLAST和DNAStar软件对5S rDNA及其非转录间隔区进行分析。从而进一步对浮萍之间亲缘关系甚至进化程度作出分析解释。

2 材料与方法

2。1 实验材料

2。1。1 实验菌株 

本实验所采用的菌株为淮安钵池山以及Nikola从美国带回的浮萍生物材料。已确定浮萍为Wolffia属，分别将浮萍编号为1(Wolffia D。、2（Wolffia。 globosa 428-DWC313）和3（Wolffia。 arrhiza）。

2。1。2 主要试剂和仪器设备 

（1）主要试剂

dNTPs(2。5mM)、DL5000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶(5U/µl)、Taq酶反应缓冲液均购自北京佳兰生物科技有限公司；引物合成由赛百盛基因技术有限公司完成；限制性内切酶EcoR-I，T4 DNA 连接酶(50U/µl)，T-Vector pMD19-T(50ng/µl)载体均由于宝生物工程（大连）有限公司(TaKaRa)提供； DNA测序由生工测序公司上海测序部完成；大肠杆菌感受态细胞为(Escherichia coli DH5α)自配；exDNA凝胶回收试剂盒由淮安百慧公司生产。

(2) 仪器设备

德国eppendorf 单道可调移液器，ABI 9700型PCR仪，DYY-6C型电泳仪，凝胶成像系统，TE612-L电子天平，Eppendorf 5418R小型温控台式离心机，DKZ-1型电热恒温振荡水槽，HZQ-F160全温振荡培养箱，SPX250B生化培养箱，BCD239BSW冰箱，TS-211C制冷型恒温摇床，上海跃进SW-CJ-2FD超净工作台。

2。2 实验方法

图1：实验思路

2。2。1 浮萍基因组DNA的提取文献综述

此过程采用改进的CATB法抽提基因组DNA[7]，步骤如下：

称取0。2g浮萍，进行研磨成浆，立即加入600µl已经预热到65℃的2× CTAB混匀，将离心管放入65℃水浴锅温浴40min，水浴过程需将离心管多次颠倒混匀。加入等体积（600µl）氯仿：异丙醇（24:1），将其再次颠倒混匀30min。于室温4000rpm/min离心20min。取上清约500µl于新的1。5ml离心管中，加入200µl含RNA酶的1M NaCl溶液，再加入2/3体积的（400µl）已预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30min或更长时间。将离心管以4000rpm/min离心10min，弃上清并控干水分。加入500µl 75%的乙醇将DNA洗涤至少20min，4000rpm/min离心10min，弃上清。重复洗涤步骤后，控干。用500µlTE溶解DNA，-20℃保存。   

2。2。2 NTS序列扩增

(1) 引物设计

根据目的基因的大小和长度，设计引物。

引物序列：5S-F1：CTTGGGCGAGAGTAGTACTAGG

          5S-R1：CACGCTTAACTTCGGAGTTCTG 

引物结合位点（图2）：第一次取用引物（呈粉末状）时，需离心后再开启，以免粉末损失。