2。叶绿素含量的测定:取80%的丙酮溶液10ml,称量0。1 g的马尾松叶片置于其中,放在黑暗处两天,每天用涡旋振荡器震荡两次,取上清液,用分光光度计测定A440、A645、A663,测定出叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素的浓度(mg/L)利用下面的公式。

Ca=12。7 A663-2。69 A645

Cb = 22。9 A645-4。68 A663

Ck =4。7 A440-0。27 Ct

Ct = Ca+Cb = 20。2 A645+8。02 A663, Ct:叶绿素总量;Ca:叶绿素 a;Cb:叶绿素 b;Ck:类胡萝卜素。

2。3。2 Al元素含量的测定

Al含量的测定采用邬智高等的方法。取10 g马尾松幼苗,在干燥箱中先烘干取出烘干的幼苗进行磨碎处理,称取0。1 g放入坩埚中 (每组处理3个重复),加入200 μl无水乙醇,在马弗炉中经过200°C、30 min→300°C、1 h→550°C、12 h灰化后,待温度降到100°C左右时取出,加入同时加入1 ml HNO3和1 ml去离子水,消解充分后转移到已作去离子处理的小瓶中,稀释50倍后用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定Al的含量。

2。3。3 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)

1。试剂的配制

(1)0。05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7。8) :

A母液:0。2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358。14)71。7g;

B母液:0。2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156。01)31。2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0。05mol/L PBS(pH7。8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228。75ml,B母液(NaH2PO4) 21。25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

(2)14。5mM甲硫氨酸溶液:取2。1637g Met用磷酸缓冲液(pH7。8)定容至1000ml。

(3)30μM EDTA-Na2溶液:取0。001g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

(4)60μM核黄素溶液:取核黄素0。0024g用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。

(5)2。25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液:取0。1840g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。

2。酶液制备:论文网

取0。5g马尾松的根洗净后置于预冷的研钵中,加入1。8ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7。8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,酶液是上清液。

3。酶活性测定

(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取6ml核黄素溶液,磷酸缓冲液5。4ml,Met溶液162ml,0。6ml EDTA-Na2溶液, NBT溶液6ml,混合后摇匀;

(2)取40μl酶液和4ml反应液混合于试管中

(3)光照培养箱中设置光照值3500 lux将试管置于其中15min;

同时做两支对照组,其中1支试管取4ml反应混合液加入40μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原组,另1支置于暗中且只加入缓冲液的对照管测定时用于调零。

(4)以暗中处理的对照管调零后,避光测OD560(出现颜色即可测定)。

(5)酶活性计算: 

SOD总活性=[( Ack-AE )×V]/(1/2Ack×W×Vt)

SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW);酶单位每毫克蛋白表示比活力单位;Ack为照光对照管的吸光度;AE为样品管的吸光度;V为样品液总体积(ml,1。6ml,加入PBS的体积);Vt为测定时的酶液用量(ml,30ul);W为样品鲜重g;蛋白质含量单位为mg/g。

2。3。4 过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)

(1)试剂配制:文献综述

0。2mol/L磷酸缓冲液(pH6。0):分别取A母液(Na2HPO4) 123ml和B母液(NaH2PO4) 877ml混匀即为1000ml PBS(0。2M,pH6。0);

(2)反应混合液配制(以60个样为准):

取200ml PBS(0。2M,pH6。0),加入0。076ml液体(原液)愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入25%的H2O20。115ml,混匀后保存于冰箱中备用。

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