2。4 试验设计

2。4。1 探究不同浓度盐胁迫对水稻幼苗的影响

对水稻幼苗进行不同浓度的盐胁迫处理,浓度分别为0 mmol/L ,50mmol/L,100mmol/L和200mmol/L NaCl。每隔2天重新换营养液并再次加入上述浓度的氯化钠[13]。分别在盐胁迫处理0h、6h、1d、2d、4d、6d、8d后,进行随机采样,重复2-3次,测定植株的株高、叶片POD、SOD以及叶片相对电导率。

2。4。2探究H2S对盐胁迫下的水稻幼苗的影响

对水稻幼苗进行分别做如下处理:0 mmol/L,50mmol/LNaCl+0。2mmol/L NaHS,100mmol/LNaCl+0。2mmol/L NaHS。每隔2天重新换营养液并重复进行上述处理。分别在盐胁迫处理0h、6h、1d、2d、4d、6d、8d后,进行随机采样,重复2-3次,测定植株的株高、叶片POD、SOD以及叶片相对电导率。

2。5 各项指标的测定方法

2。5。1植株的生长情况

分别在盐胁迫处理0h、6h、1d、2d、4d、6d、8d后,用直尺进行测量所有植株的株高,记录数据并计算出每盆植株株高的平均值[14]。

2。5。2 叶片POD、SOD活性的测定文献综述

酶液制备:取0。2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入1。6mL 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7。8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、8000r/min下离心20min,上清液即为酶液。

POD 活性测定采用愈创木酚法:取200mL PBS(0。2mol/L,pH6。0),加入0。076mL液体(原液)愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0。112mL30%的 H2O2混匀后保存于冰箱中备用。取3mL反应液并加入30µL酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值(测定40s)。(边加样边测定,测定前等待5s,动作要快,如果慢的话,要保证每一个样品从加样到开始计时的时间相差不大)。

SOD 活性测定采用氮蓝四唑比色法:每组取4支试管,分别加入配制好的3mL反应混合液(Met溶液162mL,EDTA- Na2溶液0。6mL,磷酸缓冲液5。4mL,NBT溶液6mL,核黄素溶液6mL)和30µL酶液于其中2支试管中,另外两只对照管,其中一支试管取3mL反应混合液加入30mLPBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另一支加缓冲液置于暗中测定时用于调零。将对照管置于暗处,其它三管于4000lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致)。反应结束后,以不光照的对照管做空白,避光测OD560(出现颜色即可测定)。

计算公式参照李合生[15]的方法:

POD=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0。01×t) (u/g min)

ΔA470:为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,1。6mL);Vs为测定时取用酶液体积(mL,30mL)。

SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)。

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW)Ack为照光对照管道吸光度;AE为样品管的吸光度;V为样品液总体积(mL,1。6mL,加入PBS的体积);Vt为测定时代酶液用量(mL,30µL);W为样品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体的质量mg)。其中V为提取液体积(1。6mL),W为样品鲜重(0。2g)。

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