乙草胺降解菌Sphingomonas sp.DC-6的发酵菌剂制备及应用(3)
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。LB固体培养基添加1.5%的琼脂，121℃、灭菌30 min。
1．1．3 主要试剂与材料 乙草胺（纯度>98%，使用前将上述药品溶于色谱甲醇，过滤除菌）、二氯甲烷、甲醇、无水硫酸钠、PBS缓冲液、生理盐水、海藻酸钠、壳聚糖、生物炭（biochar，马尾松树干700℃高温缺氧热解所得，粉碎机粉碎后用40目筛过筛）。
1．1．4 主要仪器 恒温培养箱、恒温鼓风干燥箱、灭菌锅、摇床、冰箱、低温高速离心机、恒温水浴锅、涡旋仪、粉碎机、扫描型紫外-可见光分光光度仪、超净工作台、分析天平、BioFlo/CelliGen 115发酵罐/生物反应器、喷雾干燥仪、液相色谱仪。
1．2 方法
1．2．1 菌种平板活化 将保存的菌种划线接种于加100 mg/kg链霉素的LB平板培养基上，置于30℃恒温培养箱倒置培养3天。挑取平板中单菌落，接种于添加30 mg/kg乙草胺和100 mg/kg链霉素的LB平板上，于30℃倒置培养3天，选用具有较大透明圈的菌落进行下一步实验。
1．2．2 种子液及摇瓶培养基的培养 种子液及摇瓶培养基均为100 ml发酵体系置于250 ml三角瓶中，于30℃恒温摇床中，180 rpm培养。种子液选取已活化的菌种接种培养。
1．2．3 发酵条件优化验证 通过定时取样测定Sphingomonas sp. DC-6摇瓶液态发酵周期中菌体的OD600、干重以及酶活，绘制出Sphingomonas sp. DC-6的生长曲线和产酶曲线及建立OD600、生物量和产酶量的关系。通过碳源、氮源等培养基组分及温度、pH和转速等发酵条件的单因素实验，确定各因素的基本范围。通过Plackett-Burman实验从确定的单因素中找出显著性影响因子，再通过Box-Behnken Design实验得到优化后发酵培养基的各个组分及培养条件。
1．2．4 发酵罐液态发酵验证 按经响应面优化得到的菌株最佳发酵条件配制培养基，装罐，灭菌。设定菌体生长最适宜的温度、pH、接种量和转速等，进行发酵罐液体发酵。
1．2．4．1 培养过程 一个典型培养周期，即菌体生长周期分为：延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期[11]。
各项发酵参数：接种量为7%，25 g/L酵母粉/(NH4)2SO4 (m/m：3/1, g/L)，15 g/L葡萄糖，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L NaCl，0.5 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4，pH6.5的发酵培养基中，30℃，180 rpm。在发酵的过程中，需加入适量消泡剂豆油，防止污染。
1．2．4．2 确定发酵液中葡萄糖质量浓度及补糖 定时取样，当发酵液中葡萄糖质量浓度低于初始浓度的1/2时开始补糖，并将葡萄糖质量浓度保持在能获得最高产量发酵液的值。
1．2．4．3 生物量的测定 选取5-10 ml的发酵液，12000 rpm离心10 min，去除上清。保留沉淀用去离子水清洗2-3次，再次离心去除上清，沉淀测重量得鲜重(mg/ml)，再烘干至恒重，得干重(mg/ml)。
1．2．4．4 发酵产物收集 按时取样，测定样液中菌体生物量(OD600)。若菌体生长周期进入稳定期，即可停止培养，通过液位电极及相应蠕动泵来完成发酵产物的收集过程。
1．2．5 制备菌制剂 设置适宜的进样量、温度、风速等条件，利用喷雾干燥仪将发酵产物制备成菌粉。
1．2．6 联合固定化
1．2．6．1 吸附法 配成生物炭悬液：将40目生物炭与该菌菌悬液按一定的配比混合，180 rpm，30℃摇床摇匀一定时间，5000 rpm离心10 min，去掉上清液，用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤，再次离心，如此反复洗涤2-3次，最后将离心后的菌体用无菌去离子水配成生物炭悬液，同时做不加菌液（用去离子水代替）的对照组，测定游离菌量(OD600)以及乙草胺降解率。