2。2  土壤样品DNA提取及DGGE分析

本研究利用FastDNA SPIN Kit for Soil（MPbio，USA）试剂盒进行土壤样品总DNA的提取，提取方法参照试剂盒实验说明。

以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列。

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2。5 mM）3。2 μL；rTaq（5 U/μL）0。4 μL；GC-338F（20 μM）1 μL；518R（20 μM）1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min； 94℃变性1 min， 55℃复性45 s，72℃延伸1 min， 30个循环；最终72℃延伸10 min。

PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

表1 土壤样品16S rDNA扩增引物信息

引物 引物序列

338F CCT ACG GGA GGC AGC AG

518R ATT ACC GCG GCT GCT GG

GC338F CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG

CCT ACG GGA GGC AGC AG论文网

DGGE梯度胶根据（Heuer et al。, 2001）的方法制备[18]。DGGE 在 DCode 突变检测系统 (Bio-Rad)中完成。用 25 µL 的 PCR 浓缩产物进行 DGGE，采用变性梯度为 30 %～60 %、 8%的丙烯酰胺凝胶（100 %浓度定义为7 mol/L尿素和 40%（v/v）的去离子甲酰胺）在 1×TAE 电泳缓冲液中，130 V 电压，60℃下电泳 7h。电泳后用银染 10-15 min、扫描并拍照。比对不同处理组和对照组之间差异性条带，切胶回收、测序比对。

2。3  土壤水解性氮的测定(碱解扩散法)

    土壤水解性氮又称碱解氮或土壤有效氮，包括无机态氮（铵态氮、硝态氮）及易水解的有机态氮（氨基酸、酰铵和易水解蛋白质)。碱解氮的含量和有机质含量及质量有关，有机质含量高，熟化程度高，有效性氮含量也高；反之，有机质含量低，熟化程度低，有效性氮的含量也低。碱解氮含量作为植物氮素营养较无机氮有更好的相关性，所以测定碱解氮比测定氨态氮和硝态氦更能确切的反映出近期内土壤的供氮水平。用碱液处理士壤时，易水解的有柳氮及铵态氮转化为氨。硝态氮则先经硫酸亚铁转化为铵。以硼酸吸收氨，再用标准酸滴定，计算水解性氮含量[19]。

2。4  土壤中速效磷的测定(碳酸氢钠法)

    石灰性土壤由于大量游离碳酸钙存在，不能用酸溶液来提取速效磷，可用碳酸盐的碱溶液。由于碳酸根的同离子效应，碳酸盐的碱溶液降低碳酸钙的溶解度，也就降低了溶液中钙的浓度，这样就有利于磷酸钙盐的提取。同时由于碳酸盐的碱溶液也降低了铝和铁离子的活性，有利于磷酸铝和磷酸铁的提取。此外，碳酸氢钠碱溶液中存在着OH-、HCO3-、CO32-等阴离子有利于吸附态磷的交换，因此，碳酸氢钠不仅适用于石灰性土壤，也适用于中性和酸性土壤中速效磷的提取。待测液用钼锑抗混合显色剂在常温下进行还原，使黄色的锑磷钼杂多酸还原成为磷钼蓝进行比色[20]。

2。5  土壤速效钾的测定(醋酸铵—火焰光度计法)

    以中性1mol/LNH4OAc溶液为浸提剂，NH4+与土壤胶体表面的K+进行交换，连同水溶性的K+一起进入溶液，浸出液中的钾可用火焰光度计法直接测定。

    称取通过2mm孔径的风干试样5。00g放于200mL的塑料瓶中，加入50mL乙酸铵溶液(土液比为1：10)，盖紧瓶塞，摇匀，在20～25℃下，150～180rpm振荡30min，过滤。用乙酸铵溶液调节仪器零点。滤液直接在火焰光度计上测定。同时做空白试验[21]。核准曲线的绘制：称取0。1907克KCl溶于1mol/L NH4OAc溶液中，完全溶解后用1mol/LNH4OAc溶液定容至1升，即为含100mg/L K的NH4OAc溶液。用时分别吸取此100mg/L K标准液0，2，5，10，20，40ml放入100ml容量瓶中，用1mol/L NH4OAc定容，即得0，2，5，10，20，40mg/L K标准系列溶液。同样品一样用火焰光度计测定，绘制标准曲线或求回归方程。