葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑敏感性基线建立及抗药性分子机制(2)
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株为葡萄炭疽病菌，采集自江苏省镇江市句容葡萄产区，由南京农业大学杀菌剂实验室保存、提供。
菌株分离：将采集到的病果用次氯酸钠消毒后，蘸取病健分界处橙色菌落转接到培养基上25℃条件下培养3-7天后，产孢后挑单孢，得到的单孢菌株培养后转接到斜面试管培养基上25℃条件下培养3天后，放到4℃冰箱中保存。
1.2药剂与培养基
96.3%苯醚甲环唑原药；98%丙环唑原药；97%咪鲜胺原药。分别预溶于甲醇配制成10000μg/ml的储备母液，4℃冰箱中保存。97.5%多菌灵原药，预溶于0.1 mol/L盐酸配制成10000μg/mlL的储备母液，4℃冰箱中保存。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L。
AEA培养基：酵母提取物5 g，NaNO3 6 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4 0.25 g，甘油20 mL，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L；
水琼脂（WA）培养基：琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L。
以上培养基使用前均经高温高压灭菌，常温保存。
1.3 葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定
菌株活化：从保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃培养5天。
分别制做苯醚甲环唑终浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml, 丙环唑浓度为0.00625、0.0125、0. 25、0.05、0.1μg/ml,咪鲜胺终浓度为0.25、0.5、1、2、4μg/ml的平板。
将供试菌株在PDA平板上于25℃预培养5天后，在菌落边缘用5 mm的打孔器打制菌碟。将菌碟菌丝面朝下接种于含系列浓度各药剂的PDA平板中央，每个浓度重复3皿。待25℃培养5-7天后，采用十字交叉法测量菌落直径（单位：mm），并计算出不同浓度处理下，各药剂分别对葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制率。
应用DPS软件，根据药剂浓度的对数值和抑制率的几率值之间的线性回归分析，计算出EC50值。本试验重复三次。
1.4苯醚甲环唑抗、感菌株的生物学特性测定
供试的8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株与测定交互抗性所采用的菌株一致。
1.4.1 菌丝生长速率测定
预培养的供试菌株，沿菌落边缘打取5 mm菌碟，分别接种于不含药剂的PDA平板上，每个菌株重复3皿。25℃培养6天后，采用十字交叉法测量菌落直径。本试验重复3次。
1.4.2产孢能力测定
将供试的苯醚甲环唑敏感菌株及抗性菌的菌碟分别接种于不含药剂的AEA平板上，每个菌株设置6个重复。在黑暗条件下，于25℃培养两周后，收集孢子。使用血球计数板统计各菌株的产孢量。本试验重复3次。
1.4.3 致病力测定
将预培养的苯醚甲环唑敏感菌株及抗性菌株分别沿菌落边缘打取5 mm的菌碟，菌丝面朝下接种于长势基本一致的葡萄果实上，每个菌株接种5颗果实，果实表皮提前进行伤口处理，套袋保湿，并保持温室温度25℃、湿度75%-90%，光照12小时。5天后测量病斑直径。本试验重复3次。
1.5 苯醚甲环唑抗、感菌株1,4-α脱甲基酶（cyp51）基因的克隆、分析
1.5.1葡萄炭疽病菌基因组DNA的提取
供试的8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株与前面试验所选用的菌株一致。采用CTAB法，经优化快速少量提取葡萄炭疽病菌基因组DNA，具体操作方法如下：
1) 将预培养的苯醚甲环唑敏感菌株及抗性菌株分别沿菌落边缘打取5 mm的菌碟，菌丝面朝下接种于PDA平板上，25℃培养5天；
2) 用灭菌的牙签刮取适量菌丝，放入2 mL离心管中；
3) 每管中加入700 μLCTAB提取液及1个直径为5 mm的钢珠；
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